Microscopie à fluorescence : coloration par immunofluorescence des sections de tissus inclus en paraffine

Source : Thomas Chaffee¹, Thomas S. Griffith^2,3,4, et Kathryn L. Schwertfeger^1,3,4
1 Département de médecine de laboratoire et de pathologie, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Département d'urologie, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Centre du cancer maçonnique, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Center for Immunology, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Les analyses pathologiques des sections de tissu peuvent être employées pour obtenir une meilleure compréhension de la structure normale de tissu et pour contribuer à notre compréhension des mécanismes de la maladie. Les biopsies tissulaires, provenant de patients ou de modèles in vivo expérimentaux, sont souvent conservées en fixant dans la formaline ou le paraformaldéhyde et en s'intégrant dans la cire de paraffine. Cela permet un stockage à long terme et la section des tissus. Les tissus sont coupés en fines sections (5 m) à l'aide d'un microtome et les sections sont adhérences à des lames de verre. Les sections de tissus peuvent être tachées avec des anticorps, qui permettent la détection de protéines spécifiques dans les sections de tissu. La coloration avec des anticorps conjugués aux fluorophores (également connu sous le nom de fluorochromes) - composés qui émettent de la lumière à des longueurs d'onde spécifiques lorsqu'il est excité par un laser - est connu sous le nom d'immunofluorescence. La capacité de détecter des protéines dans une section peut fournir des informations telles que l'hétérogénéité de type cellulaire dans le tissu, l'activation de voies de signalisation spécifiques, et l'expression des biomarqueurs. Selon les fluorophores utilisés et le type de microscope disponible pour l'analyse, plusieurs couleurs peuvent être utilisées, ce qui permet l'analyse multiplexée des cibles.

Le protocole suivant décrit les étapes de base impliquées dans la coloration d'immunofluorescence des sections incorporées de tissu de paraffine. Il est important de noter que ce protocole n'inclura aucun détail sur la fixation du tissu, le processus d'enracinement de paraffine, ou la section des tissus. Une fois que les tissus ont été sectionnés et placés sur des lames de verre, ils sont réhydratés par une série d'incubations d'éthanol gradué (EtOH). Les sections sont incubées avec un réactif de blocage pour réduire la liaison non spécifique de l'anticorps à la section tissulaire. Les sections sont ensuite incubées avec un anticorps primaire qui peut ou non être directement étiqueté avec un fluorophore. Si l'anticorps primaire n'est pas étiqueté directement, les sections sont ensuite incubées avec un anticorps secondaire étiqueté avec un fluorophore. Différents anticorps peuvent exiger des conditions de coloration différentes, de ce fait, des suggestions pour l'optimisation des anticorps sont incluses. Après le lavage pour enlever tous les anticorps non liés, les diapositives sont montées avec des supports contenant DAPI pour étiqueter fluorescentement le noyau. Une fois que le support de montage a séché, les diapositives peuvent être imaginées à l'aide d'un microscope avec des lasers qui peuvent détecter les différents fluorophores.