Immunfluoreszenzmikroskopie: Immunfluoreszenzfärbung paraffin-embedded Tissue Sections

Quelle: Thomas Chaffee¹, Thomas S. Griffith^2,3,4, und Kathryn L. Schwertfeger^1,3,4
1 Institut für Labormedizin und Pathologie, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Freimaurerkrebszentrum, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Zentrum für Immunologie, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Pathologische Analysen von Gewebeabschnitten können verwendet werden, um ein besseres Verständnis der normalen Gewebestruktur zu erhalten und zu unserem Verständnis von Krankheitsmechanismen beizutragen. Gewebebiopsien, entweder von Patienten oder aus experimentellen In-vivo-Modellen, werden oft durch Fixierung in Formalin oder Paraformaldehyd und Einbettung in Paraffinwachs konserviert. Dies ermöglicht eine langfristige Lagerung und die Verteilung des Gewebes. Gewebe werden mit einem Mikrotome in dünne Abschnitte (5 m) geschnitten und die Abschnitte auf Glasgletten verkleben. Die Gewebeabschnitte können mit Antikörpern gefärbt werden, die den Nachweis bestimmter Proteine innerhalb der Gewebeabschnitte ermöglichen. Färbung mit Antikörpern, die mit Fluorophoren konjugiert sind (auch als Fluorchrome bekannt) - Verbindungen, die Licht bei bestimmten Wellenlängen emittieren, wenn sie von einem Laser angeregt werden - wird als Immunfluoreszenz bezeichnet. Die Fähigkeit, Proteine innerhalb eines Abschnitts zu erkennen, kann Informationen wie Die heterogenität der Zelltypen im Gewebe, die Aktivierung bestimmter Signalwege und die Expression von Biomarkern liefern. Je nach verwendetem Fluorophor und Art des für die Analyse verfügbaren Mikroskops können mehrere Farben verwendet werden, was eine Multiplexanalyse von Zielen ermöglicht.

Das folgende Protokoll beschreibt die grundlegenden Schritte bei der Immunfluoreszenzfärbung von Paraffin-eingebetteten Gewebeabschnitten. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll keine Details über die Fixierung von Gewebe, den Prozess der Paraffineinbettung oder das Teilen des Gewebes enthalten wird. Nachdem Gewebe geschnitten und auf Glasrutschen platziert wurden, werden sie durch eine Reihe von abgestuften Ethanol -Inkubationen (EtOH) rehydriert. Die Abschnitte werden mit einem blockierenden Reagenz inkubiert, um die unspezifische Bindung von Antikörpern an den Gewebeabschnitt zu reduzieren. Die Abschnitte werden dann mit einem primären Antikörper inkubiert, der direkt mit einem Fluorophor beschriftet werden kann oder auch nicht. Wenn der primäre Antikörper nicht direkt beschriftet ist, werden die Abschnitte mit einem sekundären Antikörper beziffert, der mit einem Fluorophor gekennzeichnet ist. Verschiedene Antikörper können unterschiedliche Färbebedingungen erfordern, daher sind Vorschläge zur Optimierung von Antikörpern enthalten. Nach dem Waschen, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen, werden die Dias mit Medien montiert, die DAPI enthalten, um den Kern fluoreszierend zu kennzeichnen. Sobald das Montagemedium getrocknet ist, können die Dias mit einem Mikroskop mit Lasern abgebildet werden, die die verschiedenen Fluorophore erkennen können.