מקור: תומאס צ'אפי¹, תומאס ס גריפית^2,3,4, וקתרין ל. שוורטפיגר^1,3,4
¹ המחלקה לרפואת מעבדה ופתולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
² המחלקה לאורולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
³ מרכז הסרטן הבונים החופשיים, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
⁴ המרכז לאימונולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455

ניתוחים פתולוגיים של מקטעי רקמות יכולים לשמש כדי לקבל הבנה טובה יותר של מבנה רקמות נורמלי ולתרום להבנתנו את מנגנוני המחלה. ביופסיות רקמות, בין אם מחולים או ממודלים ניסיוניים ב- vivo, נשמרות לעתים קרובות על ידי תיקון בפורמלין או paraformaldehyde והטבעה שעוות פרפין. זה מאפשר אחסון לטווח ארוך עבור הרקמות להיות חתך. רקמות נחתכות למקטעים דקים (5 מיקרומטר) באמצעות מיקרוטום והמקטעים דבקים בשקופיות זכוכית. מקטעי הרקמות יכולים להיות מוכתמים בנוגדנים, המאפשרים זיהוי של חלבונים ספציפיים בתוך מקטעי הרקמה. כתמים בנוגדנים הצמודים לפלורופורים (הידועים גם בשם פלואורוכרום) - תרכובות הפולטות אור באורכי גל ספציפיים כאשר הם מתרגשים מלייזר - ידועה בשם אימונופלואורסצנטיות. היכולת לזהות חלבונים בתוך סעיף יכולה לספק מידע כגון הטרוגניות של סוג התא בתוך הרקמה, הפעלה של מסלולי איתות ספציפיים וביטוי של סמנים ביולוגיים. בהתאם פלואורופורים בשימוש וסוג של מיקרוסקופ זמין לניתוח, צבעים מרובים ניתן להשתמש, המאפשר ניתוח multiplexed של מטרות.

הפרוטוקול הבא מתאר את הצעדים הבסיסיים הכרוכים בהכתמת אימונופלואורסצנטיות של מקטעי רקמות מוטבעים בפרפין. חשוב לציין כי פרוטוקול זה לא יכלול פרטים על קיבוע הרקמה, תהליך הטמעת פרפין או חתך של הרקמות. לאחר רקמות כבר חתך והונח על שקופיות זכוכית, הם rehydrated באמצעות סדרה של דגירות אתנול מדורג (EtOH). החלקים הם דגירה עם ריאגנט חסימה כדי להפחית כריכה לא ספציפית של נוגדן לחלק הרקמה. לאחר מכן, החלקים מסומנים בנוגדן ראשוני שעשוי או לא יכול להיות מתויג ישירות עם פלואורופור. אם הנוגדן העיקרי אינו מסומן ישירות, החלקים הם דגירה עם נוגדן משני שכותרתו פלואורופור. נוגדנים שונים עשויים לדרוש תנאי הכתמה שונים, ולכן הצעות לאופטימיזציה של נוגדנים כלולים. לאחר הכביסה כדי להסיר את כל הנוגדנים הלא מאוגדים, השקופיות מותקנות עם מדיה המכילה DAPI כדי לתייג את הגרעין באופן פלואורסצנטי. לאחר שהמדיה ההרכבה התייבשה, ניתן לדמיין את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ עם לייזרים שיכולים לזהות את הפלורופורים השונים.

1. הגדרת

פרוטוקול הכתמים הטיפוסי כולל את השלבים הבאים:
1. לחות מחדש של מקטעי הרקמות בשקופיות באמצעות סדרה של אתנולים מדורגים.
2. דגירה של מקטעי הרקמה עם חוצץ חסימה, אשר יסייע לחסום כריכה לא ספציפית של נוגדן לרקמה ולהפחית פלואורסצנטיות ברקע.
3. הסרת מאגר החסימה ודגורת ...

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

איור 1:כתמי F4/80 של גידול בממארי. לאחר הקיבעון, גידול ממארי עכבר היה חתך ומוכתם עם אנטי F4/80 והותקן באמצעות מדיה הרכבה המכילה DAPI. כתמים מוצגים על ידי משטח התא F4/80 מכתים באדום.

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אימונופלואורסצנטיות מאפשרת לחקור ביטוי חלבון ולוקליזציה בהקשר של קטע רקמות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי להבין כיצד רקמות משתנות בהקשר של המחלה על ידי בחינת לוקליזציה של חלבון או מספר תאים ברקמות רגילות ומחלות. ניתן לקבוע ולקשר שינויים בשינויים בתבניות ביטוי או בתבניות ביטוי לתכונות ספציפי?...

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Im K, Mareninov S., Diaz MFP, Yong WH. An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Yong W. (eds) Biobanking. Methods in Molecular Biology. 1897, Humana Press, New York, NY (2019)
Ramos-Vara JA. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Gautier JC. (eds) Drug Safety Evaluation. Methods in Molecular Biology. 1641, Humana Press, New York, NY (2017)
Donaldson JG. Immunofluorescence Staining. Current protocols in Cell Biology. 69 (1):1 4.3.1-4.3.7. (2015)

Transcript

מיקרוסקופיה חיסונית: כתמי אימונופלואורסצנטיות של מקטעי רקמות משובצים בפרפין