Microscopia a immunofluorescenza: colorazione a immunofluorescenza di sezioni di tessuto incorporato in paraffina

Fonte: Thomas Chaffee¹, Thomas S. Griffith^2,3,4e Kathryn L. Schwertfeger^1,3,4
1 Dipartimento di Medicina e Patologia di Laboratorio, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Dipartimento di Urologia, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Masonic Cancer Center, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Centro di Immunologia, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Le analisi patologiche delle sezioni tissutali possono essere utilizzate per ottenere una migliore comprensione della normale struttura tissutale e contribuire alla nostra comprensione dei meccanismi della malattia. Le biopsie tissutali, sia da pazienti che da modelli sperimentali in vivo, sono spesso conservate fissando in formalina o paraformaldeide e incorporando nella cera di paraffina. Ciò consente la conservazione a lungo termine e il seziono dei tessuti. I tessuti vengono tagliati in sezioni sottili (5 μm) utilizzando un microtomo e le sezioni sono aderenti a vetrini. Le sezioni dei tessuti possono essere colorate con anticorpi, che consentono il rilevamento di proteine specifiche all'interno delle sezioni tissutali. La colorazione con anticorpi coniugati a fluorofori (noti anche come fluorocromi) - composti che emettono luce a lunghezze d'onda specifiche quando eccitati da un laser - è nota come immunofluorescenza. La capacità di rilevare proteine all'interno di una sezione può fornire informazioni come l'eterogeneità del tipo di cellula all'interno del tessuto, l'attivazione di specifiche vie di segnalazione e l'espressione di biomarcatori. A seconda dei fluorofori utilizzati e del tipo di microscopio disponibile per l'analisi, è possibile utilizzare più colori, il che consente l'analisi multiplexata dei bersagli.

Il seguente protocollo delinea i passaggi di base coinvolti nella colorazione immunofluorescenza delle sezioni di tessuto incorporato di paraffina. È importante notare che questo protocollo non includerà alcun dettaglio sulla fissazione del tessuto, sul processo di incorporamento della paraffina o sul sezionamento dei tessuti. Una volta che i tessuti sono stati sezionati e posizionati su vetrini, vengono reidratati attraverso una serie di incubazioni di etanolo graduato (EtOH). Le sezioni vengono incubate con un reagente bloccante per ridurre il legame non specifico dell'anticorpo alla sezione tissutale. Le sezioni vengono quindi incubate con un anticorpo primario che può o non può essere etichettato direttamente con un fluoroforo. Se l'anticorpo primario non è etichettato direttamente, le sezioni vengono quindi incubate con un anticorpo secondario etichettato con un fluoroforo. Anticorpi diversi possono richiedere condizioni di colorazione diverse, quindi sono inclusi suggerimenti per l'ottimizzazione degli anticorpi. Dopo il lavaggio per rimuovere tutti gli anticorpi non legati, i vetrini sono montati con supporti contenenti DAPI per etichettare fluorescentemente il nucleo. Una volta che il supporto di montaggio si è asciugato, i vetrini possono essere ripresi utilizzando un microscopio con laser in grado di rilevare i diversi fluorofori.