Microscopia de imunofluorescência: Coloração por imunofluorescência de secções de tecido embebidos em parafina

Fonte: Thomas Chaffee¹, Thomas S. Griffith^2,3,4, e Kathryn L. Schwertfeger^1,3,4
1 Departamento de Medicina de Laboratório e Patologia, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Departamento de Urologia, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Centro de Câncer Maçônico, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Center for Imunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Análises patológicas de seções teciduais podem ser utilizadas para obter uma melhor compreensão da estrutura tecidual normal e contribuir para a compreensão dos mecanismos da doença. Biópsias teciduais, seja de pacientes ou de modelos in vivo experimentais, são frequentemente preservadas por fixação em formalina ou paraformaldeído e incorporação em cera de parafina. Isso permite que o armazenamento a longo prazo e os tecidos sejam seccionados. Os tecidos são cortados em seções finas (5 μm) usando um microtome e as seções são aderidas a lâminas de vidro. As seções teciduais podem ser manchadas com anticorpos, que permitem a detecção de proteínas específicas dentro das seções teciduais. A coloração com anticorpos conjugados a fluoroforos (também conhecidos como fluorochromes) - compostos que emitem luz em comprimentos de onda específicos quando excitados por um laser - é conhecida como imunofluorescência. A capacidade de detectar proteínas dentro de uma seção pode fornecer informações como heterogeneidade do tipo celular dentro do tecido, ativação de vias específicas de sinalização e expressão de biomarcadores. Dependendo dos fluoroforos utilizados e do tipo de microscópio disponível para análise, podem ser utilizadas múltiplas cores, o que permite a análise multiplexada dos alvos.

O protocolo a seguir descreve as etapas básicas envolvidas na coloração da imunofluorescência das seções de tecido incorporado parafina. É importante notar que este protocolo não incluirá detalhes sobre a fixação de tecido, processo de incorporação de parafina ou secção dos tecidos. Uma vez que os tecidos são seccionados e colocados em lâminas de vidro, eles são reidratados através de uma série de incubações de etanol classificado (EtOH). As seções são incubadas com um reagente bloqueador para reduzir a ligação não específica de anticorpos à seção tecidual. As seções são então incubadas com um anticorpo primário que pode ou não ser rotulado diretamente com um fluoróforo. Se o anticorpo primário não for rotulado diretamente, as seções são então incubadas com um anticorpo secundário rotulado com um fluoróforo. Diferentes anticorpos podem exigir diferentes condições de coloração, assim estão incluídas sugestões de otimização de anticorpos. Após a lavagem para remover todos os anticorpos desvinculados, os slides são montados com mídia contendo DAPI para rotular fluorescentemente o núcleo. Uma vez que a mídia de montagem secou, os slides podem ser imagens usando um microscópio com lasers que podem detectar os diferentes fluoroforos.