Microscopía de Inmunofluorescencia: Tinción de inmunofluorescencia de secciones de tejido incrustado en parafina

Fuente: Thomas Chaffee¹, Thomas S. Griffith^2,3,4y Kathryn L. Schwertfeger^1,3,4
1 Departamento de Medicina y Patología de Laboratorio, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Departamento de Urología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Centro De Cáncer Masónico, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Centro de Inmunología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Los análisis patológicos de las secciones tisulares se pueden utilizar para obtener una mejor comprensión de la estructura normal del tejido y contribuir a nuestra comprensión de los mecanismos de la enfermedad. Las biopsias de tejido, ya sea de pacientes o de modelos experimentales in vivo, a menudo se conservan fijando en formalina o paraformaldehida e incrustando en cera de parafina. Esto permite el almacenamiento a largo plazo y la sección de los tejidos. Los tejidos se cortan en secciones delgadas (5 m) utilizando un microtome y las secciones se adhieren a los portaobjetos de vidrio. Las secciones de los tejidos se pueden teñir con anticuerpos, que permiten la detección de proteínas específicas dentro de las secciones de tejido. La tinción con anticuerpos conjugados con fluoróforos (también conocidos como fluorocromos) - compuestos que emiten luz a longitudes de onda específicas cuando excitan por un láser - se conoce como inmunofluorescencia. La capacidad de detectar proteínas dentro de una sección puede proporcionar información como la heterogeneidad del tipo celular dentro del tejido, la activación de vías de señalización específicas y la expresión de biomarcadores. Dependiendo de los fluoróforos utilizados y el tipo de microscopio disponible para el análisis, se pueden utilizar múltiples colores, lo que permite el análisis multiplexado de los objetivos.

El siguiente protocolo describe los pasos básicos involucrados en la tinción de inmunofluorescencia de las secciones de tejido incrustado de parafina. Es importante tener en cuenta que este protocolo no incluirá ningún detalle sobre la fijación del tejido, el proceso de incrustación de parafina o la sección de los tejidos. Una vez que los tejidos han sido seccionados y colocados en diapositivas de vidrio, se rehidratan a través de una serie de incubaciones de etanol calificado (EtOH). Las secciones se incuban con un reactivo de bloqueo para reducir la unión no específica de anticuerpos a la sección tisular. Las secciones se incuban con un anticuerpo primario que puede o no ser etiquetado directamente con un fluoróforo. Si el anticuerpo primario no está etiquetado directamente, las secciones se incuban con un anticuerpo secundario etiquetado con un fluoróforo. Diferentes anticuerpos pueden requerir diferentes condiciones de tinción, por lo que se incluyen sugerencias para la optimización de los anticuerpos. Después del lavado para eliminar todos los anticuerpos no unidos, las diapositivas se montan con medios que contienen DAPI para etiquetar fluorescentemente el núcleo. Una vez que el medio de montaje se ha secado, las diapositivas se pueden crear imágenes utilizando un microscopio con láseres que pueden detectar los diferentes fluoróforos.