共焦点蛍光顕微鏡:マウス線維芽細胞におけるタンパク質の局在を決定する技術

ソース: ドミニク・R・ボリノ¹, エリック・A・レゲンゾフ², トーニャ・J・ウェッブ^1
1メリーランド大学医学部微生物学・免疫学科、マーリーン・スチュワート・グリーンバウム総合癌センター、ボルチモア、メリーランド州 21201
²メリーランド大学医学部生体医工学技術センター、ボルチモア、メリーランド州 21201

共焦点蛍光顕微鏡は、従来の「広視野」上蛍光顕微鏡と比較して光学分解能の向上を可能にするイメージング技術である。共焦点顕微鏡は、一度に試料の各ピクセルにレーザー照明を指示する一連の電圧制御ミラー(ガルバノメーターまたは「ガルボミラー」)を使用して、x-y光学分解能の向上を達成することができます。さらに重要なのは、ピンホールを使用して、スキャンするZ面にない場所から発信されるフォーカス光を除去することで、優れたZ軸分解能を実現し、検出器が指定されたZ平面からデータを収集できるようにすることです。共焦点顕微鏡ではZ解像度が高いため、一連のZプレーン(Zスタックとも呼ばれる)から画像を収集し、ソフトウェアを介して3D画像を構築することが可能です。

共焦点顕微鏡のメカニズムを議論する前に、サンプルが光とどのように相互作用するかを考慮することが重要です。光は、光子、電磁エネルギーのパケットで構成されています。生物学的サンプルに衝突するフォトンは、4つの方法のいずれかでサンプルを含む分子と相互作用することができます:1)フォトンは相互作用せず、サンプルを通過します。2)フォトンが反射/散乱されます。3)光子は分子によって吸収され、吸収されたエネルギーは、総称して非放射性崩壊として知られているプロセスを通じて熱として放出されます。そして4)光子が吸収され、エネルギーが蛍光と呼ばれるプロセスを通じて二次光子として急速に放出される。蛍光発光を可能にする構造を持つ分子を蛍光素子と呼んでいます。ほとんどの生物学的サンプルには、ごくわずかな内因性蛍束蛍が含まれています。したがって、外因性蛍光体は、サンプル内の関心のある特徴を強調するために使用する必要があります。蛍光顕微鏡検査の間、サンプルは蛍光色素による吸収のための適切な波長の光で照らされる。光子を吸収すると、蛍光素は「励起」と言われ、吸収の過程は「励起」と呼ばれます。蛍光色素が光子の形でエネルギーを放出すると、プロセスは「発光」と呼ばれ、放出された光子は蛍光と呼ばれます。

蛍光色素を励起するために使用される光線は、顕微鏡の対物レンズによって焦点を合わせ、最大に焦点を合わせている「焦点」に収束します。焦点を超えて、光は再び発散します。入り口と出るビームは、焦点に触れる円錐のペアとして視覚化できます(図 1、左パネルを参照)。回折の現象は、光線をどれだけしっかりと集めることができるかに制限を課します - ビームは実際に有限サイズのスポットに焦点を合わせます。焦点点の大きさを決定する2つの要因:1)光の波長、および2)対物レンズの集光能力は、その数値絞り(NA)によって特徴付けされる。焦点「スポット」は、x-y平面だけでなく、z方向にも広がり、実際には焦点ボリュームです。この焦点容積の次元は光学イメージ投射によって達成可能な最高の決断を定義する。フォトンの数は焦点ボリューム内で最も多くなりますが、焦点の上下の円錐形の光パスには、フォトンの密度も低くなります。光路の蛍光色素は、このように興奮することができます。従来の(広視野)上蛍光顕微鏡では、焦点面の上下の蛍光が焦点外蛍光(「かすんだ背景」)に寄与し、画像の解像度とコントラストを低下させます。焦点面(赤い星)の上の蛍光を表す赤い立方体は、焦点の外の蛍光(右上)をもたらします。この問題は、ピンホールの利用のために、共焦点顕微鏡で改善される。(図2、右下)を参照してください。図3に示すように、ピンホールは、焦点の場所から検出器(左)に到達するために発生する放出を可能にし、焦点外の蛍光(右)が検出器に到達するのを妨げ、したがって、解像度とコントラストの両方を向上させます。

図 1.エピ蛍光と共焦点顕微鏡の光学分解能。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

蛍光色素を励起するために使用される光線は、顕微鏡の対物レンズによって焦点を合わせ、焦点量で収束し、発散する(左)。赤い星はイメージされているサンプルの焦点面を表し、赤い正方形は焦点面の上の蛍光色素放出を表します。エピ蛍光顕微鏡を使用してこのサンプルの画像を撮影すると、焦点が合っていない赤い正方形からの放出が見え、「曇った背景」(右上)に寄与します。共焦点顕微鏡は、焦点面の外側に放出される光の検出を防止するピンホールを備えており、「曇った背景」(右下)を排除します。

図 2.共焦点顕微鏡におけるピンホール効果この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

励起光の最高強度はレンズの焦点(左、赤楕円形)にありますが、焦点にないサンプルの他の部分(右、赤い星)は光と蛍光を得ます。これらの焦点外領域から放出される光が検出器に到達するのを防ぐために、ピンホールを持つ画面が検出器の前に存在する。焦点面から放射されるインフォーカスライト(左)のみがピンホールを通過し、検出器に到達できます。ピンホールでピンホールでピンホールでピンホールがブロックされ、検出器に到達できないピンフォーカスライト(右)。

図 3.共焦点レーザー走査顕微鏡の主成分。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

簡潔にするために、共焦点顕微鏡の機械的記述はニコンエクリプスTi A1Rの機械的記述に限定されます。異なる共焦点顕微鏡間にわずかな技術的な違いがあるかもしれませんが、A1Rは共焦点顕微鏡機能を記述するための良いモデルとして役立ちます。ダイオードレーザーの配列によって生成される励起光線は、画像化される標本に光を集中させる目的に一次ダイクロイックミラーによって反射される。一次ダイクロイックミラーは、他の波長の光が通過できるようにしながら、励起光を選択的に反射します。次に、光は、X-yの方法で標本全体の光ビームをスイープする走査ミラーに遭遇し、一度に 1 つの(x,y)ピクセルを照らします。照らされたピクセルで蛍光が放出される蛍光は、対物レンズによって収集され、一次二色鏡を通過して光増倍管(PMT)の配列に到達する。二次二次二色ミラーは、放出光を適切なPMTに向ける。ライト パスと PMT に到達します(図 3 を参照)。これにより、比較的弱い蛍光を励起光線から散乱する光によって汚染されることなく定量化することができ、これは通常、蛍光よりも大きさの大きさである。ピンホールは焦点ボリュームの外側から光をブロックするため、検出器に到着する光は、選択された狭いZ面から来ます。したがって、画像は一連の隣接するz-平面から収集できます。この一連の画像は、多くの場合「Z スタック」と呼ばれます。適切なソフトウェアを使用することにより、z-stackを処理して、試料の3D画像を生成することができます。共焦点顕微鏡検査の特に利点は、染色の細胞内局在を区別する能力である。例えば、細胞内染色からの膜染色との分化は、従来のエピ蛍光顕微鏡(1,2,3)では非常に困難である。

サンプル調製は、共焦点イメージングの重要なファセットです。光学顕微鏡検査技術の強みは、生細胞または固定細胞を画像化する柔軟性です。3D画像を生成しようとすると、Zスタックのために取得する必要がある画像の数、細胞の健康維持の難しさ、および生細胞とその小器官の動きのために、固定細胞の使用が典型的です。共焦点蛍光のための細胞を固定および染色するための手順は、免疫蛍光において従来使用されているものと同様である。チャンバースライドまたはカバースリップで培養した後、細胞は細胞形態を維持するためにパラホルムアルデヒドを使用して固定される。非特異的抗体結合は、ウシ血清アルブミン、ミルク、または正常血清を用いて遮断される。二次抗体の特異性を維持するために、使用される溶液は、一次抗体が生成されたのと同じ種に由来してはならない。細胞は、目的の抗原を結合する一次抗体でインキュベートされる。複数の細胞標的を標識する場合、一次抗体はそれぞれ異なる種から誘導されなければならない。抗原をタグ付けする抗体は、フッ素結合二次抗体によって結合される。蛍光結合二次抗体は、共焦点顕微鏡で利用可能なレーザー励起の波長と互換性があるように選択する必要があります。複数の抗原を可視化する場合、蛍光体の励起/放出スペクトルは、その信号が顕微鏡分析によって判別できるように十分に異なる必要があります。染色された標本はイメージ投射のためのスライドに取付けられる。取り付け媒体は、光漂白や試料の脱水を防ぐために使用されます。必要に応じて、核カウンターステインを含む取り付け媒体(例えばDAPIまたはホエヒト)を使用することができる(4)。

以下のプロトコルでは、CD1d(LCD1)を発現するためにトランスフェクトされたマウス線維芽細胞を、CD1dおよびCD107a(LAMP-1)を認識する抗体で染色した。CD1dは、脂質抗原を提示する抗原提示細胞の表面に存在する主要組織適合性複合体1(MHC1)様受容体である。LAMP-1(リソソーム関連膜タンパク質-1)は、主にリソソーム膜に存在する膜タンパク質である。適切な抗原の提示のために、CD1dは低pHリソソームコンパートメントを通して入稿されるので、LAMP-1はこのプロトコルのリソソームコンパートメントのマーカーとして使用されている。異なる種で産生された抗CD1dおよび抗LAMP-1を用いてLCD1細胞を調べることによって、ユニークな蛍動管を持つ二次抗体を使用して、細胞内の各タンパク質の局在化およびCD1dがLAMP-1陽性に存在するかどうかを決定することができる。リソソームコンパートメント。