공 초점 형광 현미경: 쥐 섬유 아세포에서 단백질의 국소화를 결정하는 기술

출처: 도미니크 R. 볼리노^1,에릭 A. 레겐조브^2,토냐 J. 웹^1
1 미생물학 및 면역학학과, 메릴랜드 의과 대학 및 말린과 스튜어트 그린바움 종합 암 센터, 볼티모어, 메릴랜드 21201
² 메릴랜드 대학교 의과대학, 볼티모어, 메릴랜드 주 생물의학 공학 및 기술 센터 21201

공초점 형광 현미경 검사는 기존의 "넓은 필드"상피 현미경 검사법과 비교하여 증가 된 광학 해상도를 가능하게하는 이미징 기술입니다. 공초점 현미경은 "레이저 스캐닝"을 통해 향상된 X-y 광학 해상도를 달성 할 수 있습니다 - 일반적으로 한 번에 시편의 각 픽셀에 레이저 조명을 직접 전압 제어 거울 세트 (갈바노미터 또는 "갈보"거울). 더 중요한 것은, 공초점 현미경은 핀홀을 사용하여 스캔되는 z-평면에 없는 위치에서 발생하는 초점 라이트를 제거하여 검출기가 지정된 z-평면에서 데이터를 수집할 수 있도록 함으로써 우수한 z 축 분해능을 달성한다는 것입니다. 공초점 현미경 검사법에서 달성 가능한 z 해상도가 높기 때문에 일련의 z-평면(z-stack이라고도 함)에서 이미지를 수집하고 소프트웨어를 통해 3D 이미지를 생성할 수 있습니다.

공초점 현미경의 메커니즘을 논의하기 전에 샘플이 빛과 상호 작용하는 방법을 고려하는 것이 중요합니다. 빛은 광자, 전자기 에너지 패킷으로 구성됩니다. 생물학적 샘플에 영향을 미치는 광자네는 4가지 방법 중 하나에서 샘플을 포함하는 분자와 상호 작용할 수 있습니다: 1) 광자 상호 작용하지 않고 샘플을 통과; 2) 광자 반사/산란; 3) 광자 분자에 의해 흡수되고 흡수된 에너지는 종합적으로 비방사부패로 알려진 과정을 통해 열로 방출된다; 및 4) 광자가 흡수되고 에너지는 형광으로 알려진 과정을 통해 보조 광자로 급속히 방출된다. 형광 방출을 허용하는 구조가 있는 분자는 형광증이라고 합니다. 대부분의 생물학적 샘플은 무시할 수 있는 내인성 형광을 함유하고 있습니다. 따라서 외인성 형광은 시료에 대한 관심의 특징을 강조하기 위해 사용되어야 합니다. 형광 현미경 검사관 동안, 샘플은 형광소에 의한 흡수를 위한 적당한 파장의 빛으로 조명됩니다. 광자 흡수 시, 플루오로포레는 "흥분"이라고 하며 흡수 과정은 "흥분"이라고 합니다. 형광국이 광자의 형태로 에너지를 포기하면 공정을 "방출"이라고 하며 방출된 광자는 형광이라고 합니다.

형광을 자극하는 데 사용되는 광선은 현미경의 객관적인 렌즈에 초점을 맞추고 최대 적으로 초점을 맞춘 "초점"에 수렴합니다. 초점 너머의 빛이 다시 갈라집니다. 진입 및 종료 빔은 초점에서 접촉하는 원두 쌍으로 시각화될 수 있습니다(그림 1, 왼쪽 패널 참조). 회절 현상은 빛의 광선이 얼마나 단단히 초점을 맞출 수 있는지에 제한을 가합니다 - 빔은 실제로 유한 크기의 지점에 초점을 맞춥니다. 두 가지 요인이 초점 지점의 크기를 결정합니다: 1) 빛의 파장, 2) 목표 렌즈의 광 수집 능력, 이는 그 숫자 조리개 (NA)를특징으로한다. 초점 "스팟"은 x-y 평면뿐만 아니라 z 방향으로확장되며 실제로는 초점 볼륨입니다. 이 초점 볼륨의 치수는 광학 이미징에서 달성할 수 있는 최대 해상도를 정의합니다. 광자의 수는 초점 부피 내에서 가장 크지만 초점 위와 아래에 있는 원적 광 경로에는 광자의 밀도가 낮습니다. 따라서 빛 경로의 모든 불소는 흥분 될 수 있습니다. 종래의 (와이드 필드) 상피 현미경 검사법에서, 초점 비행기 위와 아래형광에서 방출은 이미지 해상도와 대비를 감소시키는 초점 불소 형광("흐릿한 배경")을 기여하며, 그림 1에서 입증된 바와 같이, 빨간색 큐브는 평면 초점(빨간 별)의 위 형광 방출을 나타내는 것으로, 오른쪽 초점(빨간 별)의 우측 초점(오른쪽 초점)을 능가하는 것으로 간주합니다. 이 문제는 핀홀의 활용으로 인해 공초점 현미경 검사법에서 개선됩니다. (그림 2, 오른쪽 아래). 그림 3에 설명된 바와 같이 핀홀은 초점 위치에서 발생하는 배출이 검출기(왼쪽)에 도달할 수 있게 해주며, 초점이 맞지 않는 형광(오른쪽)이 검출기에 도달하지 못하도록 차단하여 해상도와 대비를 모두 향상시킵니다.

그림 1. 공초점 현미경 검사법과 피성 불피의 광학 해상도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

형광을 자극하는 데 사용되는 광선은 현미경의 객관적인 렌즈에 초점을 맞추고 초점 볼륨에서 수렴한 다음 발산 (왼쪽). 적색별은 적색 사각형이 초점 평면 위의 불소 방출을 나타내는 동안 이미지화되는 샘플의 초점 평면을 나타냅니다. 이 샘플의 이미지를 피광성 현미경을 사용하여 캡처할 때 초점이 맞지 않는 빨간색 사각형에서 방출하면 "흐릿한 배경"(오른쪽 상단)이 표시됩니다. 공초점 현미경은 초점 평면 외부에서 방출되는 빛의 검출을 방지하는 핀홀을 가지고 있어 "흐릿한 배경"(오른쪽 아래)을 제거합니다.

그림 2. 공초점 현미경 검사법의 핀홀 효과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

흥분광의 가장 높은 강도는 렌즈(왼쪽, 붉은 타원형)의 초점에 있지만, 초점(오른쪽, 붉은 별)에 있지 않은 샘플의 다른 부분은 빛과 형광을 얻을 것이다. 이러한 초점이 닿지 않는 영역에서 발광이 감지기에 도달하는 것을 방지하기 위해 핀홀이 있는 스크린이 검출기 앞에 있습니다. 초점 평면에서 방출되는 초점 표시등(왼쪽)만 핀홀을 통과하여 검출기에 도달할 수 있습니다. 초점이 맞지 않는 라이트(오른쪽)는 핀홀로 차단되어 검출기에 도달하지 못합니다.

그림 3. 공초점 레이저 스캐닝 현미경의 주요 구성 요소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

단순성을 위해, 공초점 현미경의 기계적인 설명은 니콘 이클립스 Ti A1R의 것으로 제한됩니다. 다른 공초점 현미경 사이 사소한 기술적 다름이 있을지도 모르지만, A1R은 공초점 현미경 기능을 설명하기 위한 좋은 모형으로 또한 봉사합니다. 다이오드 레이저의 배열에 의해 생성 된 흥분 광선은, 이미지되는 표본에 빛을 초점을 맞추고 목표에 기본 이차 거울에 의해 반영된다. 1차 이삭 미러는 다른 파장의 빛이 통과할 수 있도록 하면서 흥분 광을 선택적으로 반사합니다. 그런 다음 빛은 x-y 방식으로 표본을 가로 질러 광선을 쓸어 버리는 스캐닝 미러를 마주보고 한 번에 단일(x,y)픽셀을 조명합니다. 조명된 픽셀에서 형광에 의해 방출되는 형광은 객관적인 렌즈에 의해 수집되고 1차 이진거울을 통과하여 광증관(PMTs)의 배열에 도달한다. 이차 이차 이색 거울은 배출광을 적절한 PMT로 직접 지시합니다. 샘플에 의해 다시 분란된 흥분광은 1차 이색 거울에 의해 다시 시편을 향해 반사되어 검출광 경로에 진입하여 PMT에 도달하는 것을 방지한다(그림 3 참조). 이를 통해 비교적 약한 형광은 일반적으로 형광보다 더 강렬한 크기의 순서인 흥분 광 빔에서 산란된 빛에 의해 오염없이 정량화될 수 있습니다. 핀홀은 초점 부피 외부에서 빛을 차단하기 때문에 검출기에 도착하는 빛은 좁고 선택된 z-평면에서 나옵니다. 따라서 일련의 인접 z-평면으로부터 이미지를 수집할 수 있습니다. 이 일련의 이미지를 'z-스택'이라고도 합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 z-스택을처리하여 시편의 3D 이미지를 생성할 수 있습니다. 공초점 현미경 검사법의 특별한 장점은 염색의 세포 소세포 국소화를 구별하는 기능입니다. 예를 들어, 종래의 형광 현미경 검사법(1, 2, 3)으로 매우 어려운 세포 내 염색으로부터 얼룩진 막 사이의 분화.

샘플 준비는 공초점 이미징의 중요한 측면입니다. 광학 현미경 기술의 강도는 살아있는 또는 고정 된 세포를 이미지화하는 유연성입니다. z-스택을 위해 획득해야 하는 이미지의 수, 세포 건강 유지의 어려움, 살아있는 세포 및 세포기관의 이동 으로 인해 3D 이미지를 생성하려고 시도할 때 고정 된 세포의 사용이 일반적입니다. 공초점 형광을 위한 세포를 고정하고 염색하는 절차는 면역 형광에 통상적으로 사용되는 것과 유사합니다. 챔버 슬라이드 또는 커버립에 배양 후, 세포는 세포 형태를 보존하기 위해 paraformaldehyde를 사용하여 고정됩니다. 비특이적 항체 결합은 소 혈청 알부민, 우유 또는 정상 혈청을 사용하여 차단된다. 이차 항체의 특이성을 유지하기 위해, 사용된 용액은 1차 항체가 생성된 동일한 종으로부터 시작되어서는 안된다. 세포는 관심있는 항원결합하는 1 차적인 항체로 배양됩니다. 여러 세포 표적에 라벨을 붙일 때, 1차 항체는 각각 다른 종에서 파생되어야 합니다. 항원태를 태그하는 항체는 그 때 불소-공해된 이차 항체에 의해 구속됩니다. 불소엽공-공주 된 이차 항체는 공초점 현미경에서 사용할 수있는 레이저 여기의 파장과 호환되도록 선택되어야한다. 여러 항원을 시각화할 때 형광의 발각/방출 스펙트럼은 충분히 달라야 미세한 분석에 의해 신호를 차별할 수 있습니다. 염색된 견본은 그 때 화상 진찰을 위한 슬라이드에 장착됩니다. 마운팅 배지는 광표백 및 시편 탈수방지를 위해 사용됩니다. 원하는 경우 핵 카운터스테인(예: DAPI 또는 Hoechst)을 포함하는 장착 배지를 사용할 수 있습니다(4).

다음 프로토콜에서, CD1d(LCD1)를 발현하기 위해 전감염된 마우스 섬유아세포는 CD1d 및 CD107a(LAMP-1)를 인식하는 항체로 염색하였다. CD1d는 지질 항원 제시 세포를 제시하는 항원 제시 세포의 표면에 존재하는 주요 조직 적합성 복합체 1 (MHC 1)와 같은 수용체입니다. LAMP-1 (리소소피 관련 막 단백질-1)은 주로 리소말 막에 존재하는 대막 단백질이다. 적절한 항원 프리젠 테이션을 위해, CD1d는 낮은 pH 리소소말 구획을 통해 인신 매매, 그래서 LAMP-1이 프로토콜에 대한 리소소말 구획의 마커로 사용되고있다. LCD1 세포를 상이한 종에서 생산한 안티 CD1d 및 항-LAMP-1을 통해 조사함으로써, 독특한 형광을 가진 이차 항체는 감광-1 양성 리소냐 구획에 존재하는 각 단백질의 국소화를 결정하는 데 사용될 수 있다.