Cultures pures et ensemencement des géloses : isolement des colonies bactériennes pures à partir d'un échantillon mixte

Source: Tilde Andersson¹, Rolf Lood^1
1 Département des sciences cliniques Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Suède

Apparemment impossible à déterminer, la biodiversité microbienne est vraiment stupéfiante avec environ un billion d'espèces coexistantes (1,2). Bien que des climats particulièrement rudes, comme l'environnement acide de l'estomac humain (3) ou les lacs sous-glaciaires de l'Antarctique (4), puissent être dominés par une espèce spécifique, les bactéries se trouvent généralement dans les cultures mixtes. Comme chaque souche peut influencer la croissance d'une autre (5), la capacité de séparer et de cultiver des colonies « pures » (composées uniquement d'un seul type) est devenue essentielle dans les milieux cliniques et académiques. Les cultures pures permettent d'autres examens génétiques (6) et protéomiques (7), l'analyse de la pureté de l'échantillon et, peut-être plus remarquable, l'identification et la caractérisation des agents infectieux à partir d'échantillons cliniques.

Les bactéries ont un large éventail de besoins de croissance et il existe de nombreux types de supports nutritifs conçus pour soutenir à la fois les espèces non exigeantes et exigeantes (8). Les milieuis de croissance peuvent être préparés sous forme liquide (sous forme de bouillon) ou sous forme d'un agent gélifiant typiquement à base d'agar (un agent gélifiant dérivé d'algues rouges). Alors que l'inoculation directe dans le bouillon comporte le risque de générer une population bactérienne génétiquement diversifiée, voire mixte, le placage et le re-streaking crée une culture plus pure où chaque cellule a une composition génétique très similaire. La technique de la plaque de stries est basée sur la dilution progressive d'un échantillon (Figure 1), dans le but de séparer les cellules individuelles les unes des autres. Toute cellule viable (ci-après appelée unité de formation de colonie, CFU) soutenue par les médias et l'environnement désigné peut par la suite trouver une colonie isolée de cellules-filles par fission binaire. En dépit des taux rapides de mutation dans les communautés bactériennes, ce groupe de cellules est généralement considéré comme clonal. La récolte et le re-streaking de cette population assure par conséquent que les travaux ultérieurs ne concernent qu'un seul type bactérien.

Figure 1 : Une plaque de stries est basée sur la dilution progressive de l'échantillon d'origine. I) L'inoculum est d'abord dispersé à l'aide d'un mouvement en zigzag, créant une zone avec une population bactérienne relativement dense. II-IV) Les stries sont tirées de la zone précédente, à l'aide d'une boucle d'inoculation stérile à chaque fois, jusqu'à ce que le quatrième quadrant soit atteint. V) Un dernier mouvement en zigzag dirigé vers le milieu de la plaque forme une région où l'inoculum a été nettement dilué, permettant aux colonies d'apparaître séparées les unes des autres.

La technique de la plaque de stries peut également être combinée à l'utilisation de supports sélectifs et/ou différentiels. Un milieu sélectif inhibera la croissance de certains organismes(p. ex. par l'ajout d'antibiotiques) tandis qu'un milieu différentiel aidera uniquement à distinguer l'un de l'autre(par exemple par hémolyse sur les plaques d'agar sanguine).

L'utilisation de techniques aseptiques (stériles) sous-tend tous les travaux en microbiologie. Chaque culture bactérienne devrait être considérée comme potentiellement pathogène car il existe un risque de croissance involontaire de souches dangereuses, la formation d'aérosols et la contamination de l'équipement /personnel. Pour minimiser ces risques, tous les aliments pour supports, plastiques, métalliques et vitraux sont généralement stérilisés par l'autoclacage avant et après l'utilisation, les soumettant à une vapeur saturée à haute pression à environ 121 oC qui élimine efficacement les cellules persistantes. L'espace de travail est généralement désinfecté à l'aide d'éthanol avant et après l'utilisation. Le manteau de laboratoire et les gants sont toujours portés pendant le travail avec des agents infectieux.