Reinkulturen und Streak-Plating: Isolierung einzelner Bakterienkolonien aus einer gemischten Probe

Quelle: Tilde Andersson¹, Rolf Lood^1
1 Institut für Klinische Wissenschaften Lund, Abteilung für Infektionsmedizin, Biomedical Center, Universität Lund, 221 00 Lund, Schweden

Die mikrobielle Biodiversität scheint unmöglich zu bestimmen, und die mikrobielle Artenvielfalt ist mit schätzungsweise einer Billion koexistierender Arten (1,2) wirklich erstaunlich. Obwohl besonders raue Klimazonen, wie die saure Umgebung des menschlichen Magens (3) oder die subglazialen Seen der Antarktis (4), von einer bestimmten Art dominiert werden können, sind Bakterien typischerweise in Mischkulturen zu finden. Da jede Sorte das Wachstum einer anderen (5) beeinflussen kann, ist die Fähigkeit, "reine" (nur aus einem Typ bestehende) Kolonien zu trennen und zu kultivieren, sowohl im klinischen als auch im akademischen Umfeld unerlässlich geworden. Reine Kulturen ermöglichen weitere genetische (6) und proteomische Untersuchungen (7), die Analyse der Probenreinheit und, vielleicht bemerkenswerter, die Identifizierung und Charakterisierung von Infektionserregern aus klinischen Proben.

Bakterien haben eine breite Palette von Wachstumsanforderungen und es gibt zahlreiche Arten von Nährstoffmedien, die entwickelt wurden, um sowohl die unanspruchsvollen als auch die anspruchsvollen Arten zu erhalten (8). Wachstumsmedien können entweder in flüssiger Form (als Brühe) oder in einer typisch engarbasierten (einem gelierenden Mittel aus Rotalgen) feste Form hergestellt werden. Während die direkte Impfung in die Brühe das Risiko birgt, eine genetisch vielfältige oder sogar gemischte Bakterienpopulation zu erzeugen, schafft die Beschichtung und Neuung eine reinere Kultur, in der jede Zelle ein sehr ähnliches genetisches Make-up hat. Die Streifenplattentechnik basiert auf der progressiven Verdünnung einer Probe (Abbildung 1), mit dem Ziel, einzelne Zellen voneinander zu trennen. Jede lebensfähige Zelle (im Folgenden als koloniebildende Einheit, KBE bezeichnet), die von den Medien und der bezeichneten Umgebung getragen wird, kann anschließend eine isolierte Kolonie von Tochterzellen durch binäre Spaltung finden. Trotz der schnellen Mutationsraten innerhalb bakterieller Gemeinschaften wird diese Zellgruppe allgemein als klonal betrachtet. Die Ernte und Erneute Verwesung dieser Population stellt somit sicher, dass die nachfolgende Arbeit nur einen einzigen bakteriellen Typ umfasst.

Abbildung 1: Eine Streifenplatte basiert auf der progressiven Verdünnung der Originalprobe. I) Das Inokulum wird zunächst mit einer Zick-Zack-Bewegung verteilt, wodurch ein Gebiet mit einer relativ dichten Bakterienpopulation entsteht. II-IV) Streifen werden aus dem vorhergehenden Bereich gezogen, wobei jedes Mal eine sterile Impfschleife verwendet wird, bis der vierte Quadrant erreicht ist. V) Eine letzte Zick-Zack-Bewegung, die auf die Mitte der Platte gerichtet ist, bildet einen Bereich, in dem das Inokulum deutlich verdünnt wurde, so dass Kolonien getrennt voneinander erscheinen können.

Die Streifenplattentechnik kann auch mit dem Einsatz selektiver und/oder differentialer Medien kombiniert werden. Ein selektives Medium hemmt das Wachstum bestimmter Organismen(z. B. durch Zugabe von Antibiotika), während ein Differenzmedium nur dazu beiträgt, sich voneinander zu unterscheiden(z. B. durch Hämolyse auf Blutagarplatten).

Allen Arbeiten in der Mikrobiologie liegt der Einsatz aseptischer (steriler) Techniken zugrunde. Jede Bakterienkultur sollte als potenziell pathogen betrachtet werden, da die Gefahr eines unbeabsichtigten Wachstums tückischer Stämme, Aerosolbildung und Kontamination von Geräten/Personal besteht. Um diese Risiken zu minimieren, werden alle Medien-, Kunststoff-, Metall- und Glaswaren in der Regel durch Autoklavieren vor und nach dem Gebrauch sterilisiert und mit hochdruckgesättigtem Dampf bei etwa 121°C belastet, der alle verweilenden Zellen effektiv auslöscht. Der Arbeitsbereich wird in der Regel mit Ethanol sowohl vor als auch nach der Verwendung desinfiziert. Labormantel und Handschuhe werden immer bei der Arbeit mit Infektionserregern getragen.