Colture pure e piastratura per striscio: isolamento di singole colonie batteriche da un campione misto

Fonte: Tilde Andersson¹, Rolf Lood^1
1 Dipartimento di Scienze Cliniche Lund, Divisione di Medicina delle Infezioni, Centro Biomedico, Università di Lund, 221 00 Lund, Svezia

Apparentemente impossibile da determinare, la biodiversità microbica è davvero sbalorditiva con una stima di un trilione di specie coesiste (1,2). Sebbene climi particolarmente rigidi, come l'ambiente acido dello stomaco umano (3) o i laghi subglaciali dell'Antartide (4), possano essere dominati da una specie specifica, i batteri si trovano tipicamente nelle colture miste. Poiché ogni ceppo può influenzare la crescita di un altro (5), la capacità di separare e coltivare colonie "pure" (costituite da un solo tipo) è diventata essenziale sia in ambito clinico che accademico. Le colture pure consentono ulteriori esami genetici (6) e proteomici (7), l'analisi della purezza del campione e, forse più degno di nota, l'identificazione e la caratterizzazione di agenti infettivi da campioni clinici.

I batteri hanno una vasta gamma di requisiti di crescita e ci sono numerosi tipi di mezzi nutritivi progettati per sostenere sia le specie poco esigenti che le specie esigenti (8). I mezzi di crescita possono essere preparati sia in forma liquida (come brodo) che in una forma solida tipicamente a base di agar (un agente gelificante derivato dalle alghe rosse). Mentre l'inoculazione diretta in brodo comporta il rischio di generare una popolazione batterica geneticamente diversificata o addirittura mista, la placcatura e la ri-striatura creano una coltura più pura in cui ogni cellula ha un corredo genetico molto simile. La tecnica della piastra striata si basa sulla progressiva diluizione di un campione (Figura 1), con l'obiettivo di separare le singole cellule l'una dall'altra. Qualsiasi cellula vitale (di seguito denominata unità formante colonia, CFU) sostenuta dal mezzo e dall'ambiente designato può successivamente trovare una colonia isolata di cellule figlie attraverso la fissione binaria. Nonostante i rapidi tassi di mutazione all'interno delle comunità batteriche, questo gruppo di cellule è generalmente considerato clonale. La raccolta e la ri-striatura di questa popolazione assicura di conseguenza che il lavoro successivo coinvolga solo un singolo tipo batterico.

Figura 1: Una piastra striata si basa sulla diluizione progressiva del campione originale. I) L'inoculo viene inizialmente disperso utilizzando un movimento a zig-zag, creando un'area con una popolazione batterica relativamente densa. II-IV) Le strisce vengono disegnate dall'area precedente, utilizzando ogni volta un ciclo di inoculazione sterile, fino a raggiungere il quarto quadrante. V) Un movimento finale a zig-zag diretto verso il centro della placca forma una regione in cui l'inoculo è stato marcatamente diluito, permettendo alle colonie di apparire separate l'una dall'altra.

La tecnica della piastra striata può anche essere combinata con l'uso di mezzi selettivi e/o differenziali. Un mezzo selettivo inibisce la crescita di alcuni organismi(ad esempio attraverso l'aggiunta di antibiotici) mentre un mezzo differenziale aiuterà esclusivamente a distinguere l'uno dall'altro(ad esempio attraverso l'emolisi su piastre di agar nel sangue).

Alla base di tutto il lavoro in microbiologia c'è l'uso di tecniche asettiche (sterili). Ogni coltura batterica deve essere considerata potenzialmente patogena in quanto vi è il rischio di crescita involontaria di ceppi insidiosi, formazione di aerosol e contaminazione di attrezzature/personale. Per ridurre al minimo questi rischi, tutti i supporti, gli articoli in plastica, metallo e vetro vengono in genere sterilizzati attraverso l'autoclave prima e dopo l'uso, sottoponendoli a vapore saturo ad alta pressione a circa 121 ° C che elimina efficacemente le cellule persistenti. Lo spazio di lavoro viene generalmente disinfettato utilizzando etanolo sia prima che dopo l'uso. Il cappotto da laboratorio e i guanti sono sempre indossati durante il lavoro con agenti infettivi.