Culturas puras e semeadura por esgotamento: isolamento de colônias bacterianas únicas de uma amostra mista

Fonte: Tilde Andersson¹, Rolf Lood^1
1 Departamento de Ciências Clínicas Lund, Divisão de Medicina de Infecção, Centro Biomédico, Universidade de Lund, 221 00 Lund, Suécia

Aparentemente impossível de determinar, a biodiversidade microbiana é verdadeiramente surpreendente com uma estimativa de um trilhão de espécies coexistindo (1,2). Embora climas particularmente severos, como o ambiente ácido do estômago humano (3) ou os lagos subglaciais da Antártida (4), possam ser dominados por uma espécie específica, as bactérias são tipicamente encontradas em culturas mistas. Como cada cepa pode influenciar o crescimento de outra (5), a capacidade de separar e cultivar colônias "puras" (consistindo apenas de um tipo) tornou-se essencial em ambientes clínicos e acadêmicos. Culturas puras permitem mais exames genéticos (6) e proteômicos (7), análise da pureza amostral e, talvez mais notável, a identificação e caracterização de agentes infecciosos a partir de amostras clínicas.

As bactérias têm uma ampla gama de requisitos de crescimento e existem inúmeros tipos de mídia de nutrientes projetadas para sustentar tanto as espécies não exigentes quanto as meticulosas (8). A mídia de crescimento pode ser preparada na forma líquida (como um caldo) ou em uma forma sólida tipicamente baseada em ágar (um agente de gelling derivado de algas vermelhas). Considerando que a inoculação direta no caldo traz o risco de gerar uma população bacteriana geneticamente diversa ou mesmo mista, chapeamento e re-streaking cria uma cultura mais pura onde cada célula tem uma composição genética altamente semelhante. A técnica da placa de raia baseia-se na diluição progressiva de uma amostra(Figura 1),com o objetivo de separar células individuais umas das outras. Qualquer célula viável (doravante referida como uma unidade formadora de colônias, CFU) sustentada pela mídia e ambiente designado pode posteriormente encontrar uma colônia isolada de células filhas através de fissão binária. Apesar das rápidas taxas de mutação dentro das comunidades bacterianas, esse grupo celular é geralmente considerado clonal. A colheita e re-streaking dessa população, consequentemente, garante que o trabalho subsequente envolva apenas um único tipo de bactéria.

Figura 1: Uma placa de raia é baseada na diluição progressiva da amostra original. I) O inóculo é inicialmente disperso usando um movimento em zig-zag, criando uma área com uma população bacteriana relativamente densa. II-IV) As listras são extraídas da área anterior, usando um laço de inoculação estéril cada vez, até que o quarto quadrante seja atingido. V) Um movimento final em zigue-zague direcionado para o meio da placa forma uma região onde o inóculo foi marcadamente diluído, permitindo que as colônias apareçam separadas umas das outras.

A técnica da placa de raia também pode ser combinada com o uso de mídias seletivas e/ou diferenciais. Um meio seletivo inibirá o crescimento de certos organismos ( porexemplo, através da adição de antibióticos), enquanto um meio diferencial só ajudará a distinguir um do outro (por exemplo, através da hemolise em placas de ágar sanguíneo).

Por trás de todo o trabalho em microbiologia está o uso de técnicas assépticas (estéreis). Toda cultura bacteriana deve ser considerada potencialmente patogênica, pois há risco de crescimento não intencional de cepas traiçoeiras, formação de aerossol e contaminação de equipamentos/pessoal. Para minimizar esses riscos, todas as mídias, plásticos, metal e vidro são tipicamente esterilizados através de autoclaving antes e depois do uso, submetendo-os a vapor saturado de alta pressão em torno de 121°C que efetivamente elimina quaisquer células persistentes. O espaço de trabalho é geralmente desinfetado usando etanol antes e depois do uso. Jaleco e luvas são sempre usados durante o trabalho com agentes infecciosos.