Sequenziamento dell'rRNA 16S: una tecnica basata sulla PCR per identificare le specie batteriche

Fonte: Ewa Bukowska-Faniband¹, Tilde Andersson¹, Rolf Lood^1
1 Dipartimento di Scienze Cliniche Lund, Divisione di Medicina delle Infezioni, Centro Biomedico, Università di Lund, 221 00 Lund, Svezia

Il pianeta Terra è un habitat per milioni di specie batteriche, ognuna delle quali ha caratteristiche specifiche. L'identificazione delle specie batteriche è ampiamente utilizzata nell'ecologia microbica per determinare la biodiversità dei campioni ambientali e la microbiologia medica per diagnosticare i pazienti infetti. I batteri possono essere classificati utilizzando metodi microbiologici convenzionali, come la microscopia, la crescita su supporti specifici, test biochimici e sierologici e saggi di sensibilità agli antibiotici. Negli ultimi decenni, i metodi di microbiologia molecolare hanno rivoluzionato l'identificazione batterica. Un metodo popolare è il sequenziamento del gene dell'RNA ribosomiale 16S (rRNA). Questo metodo non è solo più veloce e più accurato rispetto ai metodi convenzionali, ma consente anche l'identificazione di ceppi difficili da coltivare in condizioni di laboratorio. Inoltre, la differenziazione dei ceppi a livello molecolare consente la discriminazione tra batteri fenotipicamente identici (1-4).

L'rRNA 16S si unisce a un complesso di 19 proteine per formare una subunità 30S del ribosoma batterico (5). È codificato dal gene rRNA 16S, che è presente e altamente conservato in tutti i batteri grazie alla sua funzione essenziale nell'assemblaggio dei ribosomi; tuttavia, contiene anche regioni variabili che possono fungere da impronte digitali per particolari specie. Queste caratteristiche hanno reso il gene rRNA 16S un frammento genetico ideale da utilizzare nell'identificazione, nel confronto e nella classificazione filogenetica dei batteri (6).

Il sequenziamento del gene rRNA 16S si basa sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) (7-8) seguita dal sequenziamento del DNA (9). La PCR è un metodo di biologia molecolare utilizzato per amplificare specifici frammenti di DNA attraverso una serie di cicli che includono:

i) Denaturazione di un modello di DNA a doppio filamento
ii) Ricottura di primer (oligonucleotidi corti) complementari al template
iii) Estensione dei primer da parte dell'enzima DNA polimerasi, che sintetizza un nuovo filamento di DNA

Una panoramica schematica del metodo è illustrata nella Figura 1.

Figura 1: Panoramica schematica della reazione PCR. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Ci sono diversi fattori che sono importanti per una reazione PCR di successo, uno dei quali è la qualità del modello di DNA. L'isolamento del DNA cromosomico dai batteri può essere eseguito utilizzando protocolli standard o kit commerciali. Particolare attenzione deve essere prestata per ottenere DNA privo di contaminanti che possono inibire la reazione PCR.

Le regioni conservate del gene rRNA 16S consentono la progettazione di coppie di primer universali (una in avanti e una inversa) che possono legarsi e amplificare la regione bersaglio in qualsiasi specie batterica. L'area di destinazione può variare in termini di dimensioni. Mentre alcune coppie di primer possono amplificare la maggior parte del gene rRNA 16S, altre amplificano solo parti di esso. Esempi di primer di uso comune sono mostrati nella Tabella 1 e i loro siti di legame sono illustrati nella Figura 2.

Tabella 1: Esempi di oligonucleotidi standard utilizzati nell'amplificazione dei geni rRNA 16S ^a).
^a) Le lunghezze previste del prodotto PCR generato utilizzando le diverse combinazioni di primer possono essere stimate calcolando la distanza tra i siti di legame per il primer avanti e il primer inverso (vedi Figura 2), ad esempio la dimensione del prodotto PCR utilizzando la coppia di primer 8F-1492R è ~ 1500 bp e per la coppia di primer 27F-911R ~ 900 bp.
^b) noto anche come fD1

Figura 2: Figura rappresentativa della sequenza di rRNA 16S e dei siti di legame del primer. Le regioni conservate sono colorate in grigio e le regioni variabili sono riempite con linee diagonali. Per consentire la massima risoluzione, il primer 8F e 1492R (nome basato sulla posizione sulla sequenza di rRNA) vengono utilizzati per amplificare l'intera sequenza, consentendo il sequenziamento di diverse regioni variabili del gene. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le condizioni cicliche per la PCR(cioè la temperatura e il tempo necessari per denaturare il DNA, ricotto con primer e sintetizzato) dipendono dal tipo di polimerasi utilizzata e dalle proprietà dei primer. Si consiglia di seguire le linee guida del produttore per una particolare polimerasi.

Dopo aver completato il programma PCR, i prodotti vengono analizzati mediante elettroforesi su gel di agarose. Una PCR di successo produce una singola banda di dimensioni previste. Il prodotto deve essere purificato prima del sequenziamento per rimuovere i primer residui, i desossiribonucleotidi, la polimerasi e il tampone che erano presenti nella reazione PCR. I frammenti di DNA purificati vengono solitamente inviati per il sequenziamento ai servizi di sequenziamento commerciali; tuttavia, alcune istituzioni eseguono il sequenziamento del DNA presso le proprie strutture principali.

La sequenza di DNA viene generata automaticamente da un cromatogramma del DNA da un computer e deve essere attentamente controllata per verificare la qualità, poiché a volte è necessaria la modifica manuale. Seguendo questo passaggio, la sequenza genica viene confrontata con le sequenze depositate nel database dell'rRNA 16S. Vengono identificate le regioni di somiglianza e vengono consegnate le sequenze più simili.