בדיקת רגישות אנטיביוטית: בדיקות אפסילומטר לקביעת ערכי המיקרופון של שתי אנטיביוטיקות והערכה של סינרגיה אנטיביוטית

מקור: אנה בלכברג¹, רולף לוד^1
1 המחלקה למדעים קליניים לונד, החטיבה לרפואת זיהומים, המרכז הביו-רפואי, אוניברסיטת לונד, 221 00 לונד שבדיה

הידע על האינטראקציות בין אנטיביוטיקה לחיידקים חשוב בהבנת האופן שבו חיידקים מפתחים עמידות לאנטיביוטיקה. בשנת 1928, אלכסנדר פלמינג גילה פניצילין, אנטיביוטיקה המפעילה את תפקודה האנטיבקטריאלי על ידי הפרעה להתחדשות דופן התא (1). אנטיביוטיקה אחרת עם מנגנוני פעולה מגוונים התגלו לאחר מכן, כולל תרופות המעכבות שכפול DNA ותרגום חלבונים בחיידקים; עם זאת, לא פותחו אנטיביוטיקה חדשה בשנים האחרונות. העמידות לאנטיביוטיקה הנוכחית גדלה, וכתוצאה מכך מחלות זיהומיות חמורות שלא ניתן לטפל בהן ביעילות (2). כאן, אנו מתארים מספר שיטות להערכת עמידות לאנטיביוטיקה באוכלוסיות חיידקים. כל אחת מהשיטות האלה עובדת, ללא קשר למנגנון הפעולה של האנטיביוטיקה המשמשת, כי מוות חיידקי הוא התוצאה הנמדדת. עמידות לאנטיביוטיקה מופצת לא רק במהירות במיוחד באמצעות הגדרות בית החולים, אלא גם ברחבי החברה. על מנת לחקור אמצעי התנגדות כאלה, פותחו שיטות שונות כולל מבחן אפסילומטר (מבחן E) ומבחן דילול מרק (3).

מבחן E הוא שיטה מבוססת היטב והוא כלי חסכוני המכמת נתוני ריכוז מעכבות מינימלי (MIC), הריכוז הנמוך ביותר של מיקרוביאלית המעכבת צמיחה גלויה של מיקרואורגניזם. בהתאם לזן החיידקי והאנטיביוטיקה המשמשת, ערך המיקרופון יכול להשתנות בין תת מיקרוגרם / מ"ל >1000 מיקרוגרם / מ"ל (4). הבדיקה האלקטרונית מתבצעת באמצעות רצועת פלסטיק המכילה שיפוע אנטיביוטי מוגדר מראש, המוטבע בסולם הקריאה MIC ב- μg/ mL. רצועה זו מועברת ישירות על מטריצת אגר כאשר מוחל על צלחת אגר מחוסנת. לאחר הדגירה, אזור עיכוב אליפטי סימטרי נראה לאורך הרצועה כמו צמיחה חיידקית נמנעת. מיקרופון מוגדר על ידי אזור העיכוב, שהוא נקודת הקצה שבה האליפסה מצטלבים עם הרצועה. שיטה נפוצה נוספת לקביעת MIC היא שיטת דילול המיקרו-ברות. דילול Microbroth משלב ריכוזים שונים של חומר מיקרוביאלית הוסיף למדיום מרק המכיל חיידקים מחוסנים. לאחר הדגירה, MIC מוגדר הריכוז הנמוך ביותר של אנטיביוטיקה המונע צמיחה גלויה (5). זוהי גם שיטה כמותית וניתן להחיל אותה על מספר חיידקים. חסרונות של שיטה זו כוללים את האפשרות של שגיאות בעת הכנת הריכוזים של ריאגנטים ואת המספר הגדול של ריאגנטים הנדרשים לניסוי. מדידת עמידות לאנטיביוטיקה היא הכרחית הן מנקודת מבט קלינית והן מבחינה מחקרית, ושיטות במבחנה אלה של חקירת התנגדות נדונות ומציגות לראווה להלן.

ניתן ליישם את פרופיל ההתנגדות לחיידק מסוים על מנת לייעל את הטיפול האנטיביוטי כדי לקבוע אם המטופל יפיק תועלת מטיפול משולב לעומת טיפול יחיד. לשימוש ביותר מאנטיביוטיקה אחת בבת אחת, חובה לדעת את האינטראקציות שלהם זה עם זה ואם יש להם אפקט תוסף, סינרגטי או עוין. אפקט תוסף ניתן לראות כאשר ההשפעה המשותפת של האנטיביוטיקה שווה את העוצמה של אנטיביוטיקה בודדים הניתנים במינון שווה. סינרגיה בין אנטיביוטיקה, לעומת זאת, קיימת כאשר ההשפעה המשותפת של האנטיביוטיקה חזקה יותר מאשר אם התרופה תינתן לבד (6). החלת שילובים של טיפול מיקרוביאלי משמשת כדי למנוע את התרחשות ההתנגדות מיקרוביאלית ובכך לשפר את ההשפעה של הטיפול האנטיביוטי הפרטני (7). ידע באנטגוניזם חשוב גם כדי למנוע שימוש מיותר בשילובים מיקרוביאליים. מתודולוגיית הבדיקה האלקטרונית מציעה דרכים פשוטות ומספר דרכים לקבוע סינרגיה ואנטגוניזם אפשריים בין סוכנים מיקרוביאליים שונים. על מנת להתמודד עם התפשטות של פתוגנים עמידים לאנטיביוטיקה, ידע על מנגנונים סינרגטיים ואנטגוניסטיים אפשריים של אנטיביוטיקה מסוימת חשוב וכתוצאה מכך יעילות קלינית ונאבקים בעמידות רב-דרוגית.

ניתן לחלק את קביעת סינרגיה באמצעות בדיקות אלקטרוניות לשתי גישות רחבות: בדיקות צולבות ולא צולבות. בעוד ששני מבחני הסינרגיה מסתמכים על הידע הקודם של ערכי MIC בודדים, שתי הגישות שונות במקצת במתודולוגיה ובגישה המושגית. בבדיקת סינרגיה לא צולבת, האנטיביוטיקה הראשונה בזוג שנבדקה מונחת על צלחת אגר מחוסנת בחיידקים. לאחר מתן אפשרות לאנטיביוטיקה מהרצועה הראשונה להחדיר את הצלחת (למשל לאחר שעה), הרצועה מוסרת ורצועה חדשה המכילה את האנטיביוטיקה השנייה ממוקמת בדיוק באותו מקום כמו הראשון, תוך הקפדה למקם את שני ערכי המיקרופון הבודדים זה על גבי זה. לאחר מכן ניתן לנתח את אזור העיכוב המתקבל כמתואר לעיל, וסינרגיה מחושבת בהתבסס על המשוואה 1.

משוואה 1 - ריכוזי מעכבי שברים (FIC)

ערכים >0.5 מדגימים סינרגיה.

תוך מתן תגמול לבוחן עם לוחות קלים לניתוח, השיטה היא קצת מייגע וגוזל זמן רב עקב שינוי רצועות, כמו גם את הצורך להשתמש בשתי צלחות לכל ניסוי. במקום זאת, לעתים קרובות משתמשים במבחן צולב. במקום להוסיף את שתי רצועות ה- E-test השונות לאחר מכן זו על גבי זו (לאחר הסרת הראשונה), שתיהן ממוקמות בו-זמנית אך בצורה של צלב (זווית של 90°), כאשר שני ערכי המיקרופון שנקבעו בעבר יוצרים את זווית 90°. בגישה זו יש צורך רק צלחת אחת לכל מבחן סינרגיה, כמו גם פחות עבודה, מה שהופך אותו לבחירה מועדפת למרות היותו קצת יותר קשה לנתח. ניתן לדמיין את ערכי המיקרופון החדשים בגישה המשולבת של האנטיביוטיקה כאזרי העיכוב המותאמים, ולאחר מכן ניתן לקבוע סינרגיה על ידי משוואה 1.

במקום להשתמש בגישה של צלחת אגר, גישה microbroth לעתים קרובות יכול להיות מועדף בשל הגמישות הגבוהה יותר שלה (למשל היכולת לבחור ריכוזים ספציפיים של אנטיביוטיקה מחוץ לגבולות של רצועת בדיקה אלקטרונית). יתר על כן, בדיקות microbroth מוצעים להיות רגישים יותר בשל הפצה זוגית של אנטיביוטיקה בתמיסה נוזלית, לא בהתאם לניתוק בתוך שלב מוצק (צלחת אגר). בארות במיקרו-לוחית של 96 בארות יתחסנו עם מספר מוגדר של חיידקים (10⁶ cfu/mL: ריכוז חיידקים ניתן להעריך על ידי מדידות OD600 ננומטר, תקני עכוז, או על ידי הפצת דגימות ציפוי מ 10x דילול סדרתי חיידקי), ואנטיביוטיקה בדילולים שונים תתווסף לבארות. באופן דומה, לרצועות E-test MIC נקבע כצומת (טוב / נקודה) עם הריכוז הנמוך ביותר של אנטיביוטיקה מעכב צמיחה גלויה של חיידקים.

מטרה ניסיונית

• הפרויקט שלהלן מתאר אסטרטגיות לקביעת ערכי MIC של פניצילין G וג'נטמיצין של קבוצת סטרפטוקוקוס G על ידי שתי שיטות שונות, E-test ודילול מיקרו-ברוט. עבור E-test, לוחות אגר מולר-הינטון מחוסנים עם קבוצת סטרפטוקוקוס G שימשו בשילוב עם רצועות הדרגתיות של פניצילין G ו / או גנטמיצין; בעוד מרק MH עם 50% דם סוס lysed ו 20 מ"ג / מ"ל β-NAD שימשו עם אנטיביוטיקה מסיסה יחד עם קבוצת סטרפטוקוקוס G בגישה microbroth.

חומרים

• מושבות חיידקים על צלחת אגר דם, מאוחסנות <7 ימים ב 4°C
• לוחות אגר דם
• 0.5 תקן מקפרלנד
  • 1% בק"ק₂
  • 1% H₂SO₄
• צינור תמיסת מלח (2 מ"ל)
• אפליקטור עם קצה כותנה
• צלחות אגר מולר-הינטון (לוחות MHA)
• מרק MH עם 50% דם סוס lysed ו 20 מ"ג / מ"ל β-NAD (MH-F)
• פניצילין/גנטמיצין (או אנטיביוטיקה מעניינת) (BioMerieux, מרסי ל'אטואל, צרפת, שוודיה)
• פניצילין/גנטמיצין אנטיביוטיקה (או אנטיביוטיקה מעניינת (אבקה/פתרון))

הערה: המדיה הספציפית המשמשת לצמיחת חיידקים עשויה להשתנות עבור מינים שונים.