Teste de sucetibilidade a antibióticos: testes de epsilômetro para determinar valores de MIC de dois antibióticos e avaliar a sinergia de antibióticos

Fonte: Anna Bläckberg¹, Rolf Lood^1
1 Departamento de Ciências Clínicas Lund, Divisão de Medicina de Infecção, Centro Biomédico, Universidade de Lund, 221 00 Lund Suécia

O conhecimento das interações entre antibióticos e bactérias é importante para entender como micróbios evoluem a resistência a antibióticos. Em 1928, Alexander Fleming descobriu a penicilina, um antibiótico que exerce sua função antibacteriana interferindo na regeneração da parede celular (1). Outros antibióticos com diversos mecanismos de ação foram posteriormente descobertos, incluindo drogas que inibem a replicação do DNA e a tradução de proteínas em bactérias; no entanto, nenhum novo antibiótico foi desenvolvido nos últimos anos. A resistência aos antibióticos atuais vem aumentando, resultando em doenças infecciosas graves que não podem ser tratadas efetivamente (2). Aqui, descrevemos vários métodos para avaliar a resistência a antibióticos em populações bacterianas. Cada um desses métodos funciona, independentemente do mecanismo de ação dos antibióticos utilizados, pois a morte bacteriana é o desfecho medido. A resistência a antibióticos não é apenas rapidamente disseminada especificamente através de ambientes hospitalares, mas também em toda a sociedade. Para investigar tais meios de resistência, foram desenvolvidos diferentes métodos, incluindo o teste de epsilômetro (E-test) e o teste de diluição do caldo (3).

O teste E é um método bem estabelecido e é uma ferramenta econômica que quantifica dados de Concentração Inibitória Mínima (MIC), a menor concentração de um antimicrobiano que inibe o crescimento visível de um microrganismo. Dependendo da cepa bacteriana e dos antibióticos utilizados, o valor mic pode variar entre sub μg/mL a >1000 μg/mL (4). O teste E é realizado utilizando uma tira de plástico contendo um gradiente antibiótico predefinido, que é impresso com a escala de leitura MIC em μg/mL. Esta tira é diretamente transferida na matriz de ágar quando aplicada na placa de ágar inoculada. Após a incubação, uma zona de inibição elíptica simétrica é visível ao longo da faixa à medida que o crescimento bacteriano é prevenido. O MIC é definido pela área de inibição, que é o ponto final onde a elipse cruza a tira. Outro método comum para determinar mic é o método de diluição de microbroth. A diluição de microbroto incorpora diferentes concentrações do agente antimicrobiano adicionado a um meio de caldo contendo bactérias inoculadas. Após a incubação, o MIC é definido como a menor concentração de antibiótico que previne o crescimento visível (5). É também um método quantitativo e pode ser aplicado a várias bactérias. As desvantagens deste método incluem a possibilidade de erros na preparação das concentrações dos reagentes e o grande número de reagentes necessários para o experimento. Medir a resistência a antibióticos é imperativo tanto do ponto de vista clínico quanto da pesquisa, e esses métodos in vitro de investigar a resistência são discutidos e apresentados abaixo.

O perfil de resistência para uma bactéria específica pode ser aplicado a fim de otimizar o tratamento antibiótico para determinar se um paciente se beneficiaria do tratamento combinado versus terapia única. Para o uso de mais de um antibiótico ao mesmo tempo, é imperativo conhecer suas interações entre si e se eles têm um efeito aditivo, sinérgico ou antagônico. Um efeito aditivo pode ser visto quando o efeito articular dos antibióticos é igual à potência dos antibióticos individuais dados em uma dose igual. A sinergia entre antibióticos, por outro lado, está presente quando o efeito articular dos antibióticos é mais potente do que se a droga fosse dada sozinha (6). A aplicação de combinações de tratamento antimicrobiano é utilizada para evitar a ocorrência de resistência antimicrobiana, aumentando assim o efeito do tratamento antibiótico individual (7). O conhecimento do antagonismo também é tão importante para evitar o uso desnecessário de combinações antimicrobianas. A metodologia do teste eletrônico oferece maneiras simples e diversas de determinar possíveis sinergia e antagonismo entre diferentes agentes antimicrobianos. Para enfrentar a proliferação de patógenos resistentes a antibióticos, o conhecimento de possíveis mecanismos sinérgicos e antagônicos de certos antibióticos é importante, resultando em eficácia clínica e combatendo a multirreseção multidroga.

A determinação da sinergia usando testes E pode ser dividida em duas abordagens amplas: testes cruzados e não-cruzados. Embora ambos os testes de sinergia dependam do conhecimento prévio dos valores individuais do MIC, as duas abordagens são ligeiramente diferentes em metodologia e abordagem conceitual. Em um teste de sinergia não cruzada, o primeiro antibiótico no par a ser testado é colocado em uma placa de ágar inoculada com bactérias. Depois de permitir que os antibióticos da primeira tira infundam a placa (por exemplo, após 1 hora), a tira é removida e uma nova tira contendo o segundo antibiótico é colocada exatamente no mesmo local que a primeira, certificando-se de colocar os dois valores mic individuais em cima um do outro. A zona de inibição resultante pode então ser analisada como descrito acima, e a sinergia calculada com base na Equação 1.

Equação 1 - Concentrações Inibitórias Fracionárias (FIC)

Valores >0,5 demonstram sinergia.

Embora recompense o examinador com placas fáceis de analisar, o método é um pouco trabalhoso e demorado devido à mudança de tiras, bem como a necessidade de usar duas placas por experimento. Em vez disso, um teste cruzado é frequentemente empregado. Em vez de adicionar as duas diferentes tiras de teste E posteriormente em cima uma da outra (após a remoção da primeira), ambas são colocadas simultaneamente, mas na forma de uma cruz (ângulo de 90°), com os dois valores MIC previamente determinados formando o ângulo de 90°. Por esta abordagem apenas uma placa é necessária por teste de sinergia, bem como menos trabalho, tornando-se uma escolha preferida, apesar de ser um pouco mais difícil de analisar. Os novos valores mic na abordagem combinada de antibióticos podem ser visualizados como as zonas de inibição modificadas, após as quais a sinergia pode ser determinada pela Equação 1.

Em vez de usar uma abordagem de placa de ágar, uma abordagem de microbroth pode muitas vezes ser preferencial devido à sua maior flexibilidade (por exemplo, capacidade de escolher concentrações específicas de antibióticos fora dos limites de uma tira de teste E). Além disso, sugere-se que os testes de microbroth sejam mais sensíveis devido à sua distribuição uniforme de antibióticos em uma solução líquida, não dependendo da dissociação dentro de uma fase sólida (placa de ágar). Poços em uma microplaca de 96 poços serão inoculados com um número definido de bactérias (10⁶ cfu/mL: a concentração bacteriana pode ser estimada por medidas de OD600 nm, padrões de turbidez, ou por amostras de revestimento espalhadas de diluições bacterianas 10x), e antibióticos em diferentes diluições serão adicionados aos poços. Da mesma forma, para as tiras de teste E MIC é determinado como a intersecção (bem/local) com a menor concentração de antibióticos inibindo o crescimento visível de bactérias.

Objetivo Experimental

• O projeto abaixo descreve estratégias para determinar os valores MIC da penicilina G e gentamicina do grupo G de Streptococcus por dois métodos diferentes, e-test e diluição de microbroth. Para o teste eletrônico, as placas de ágar Mueller-Hinton inoculadas com o grupo Streptococcus G foram utilizadas em combinação com tiras gradientes de penicilina G e/ou gentamicina; enquanto o caldo MH com 50% de sangue de cavalo e 20 mg/mL β-NAD foram usados com antibióticos solúveis juntamente com o grupo G em uma abordagem de microbroth.

Materiais

• Colônias bacterianas em uma placa de ágar de sangue, armazenadas <7 dias em 4°C
• Placas de ágar de sangue
• 0.5 Padrão McFarland
  • 1% BaCl₂
  • 1% H₂SO₄
• Tubo salino (2 mL)
• Aplicador de ponta de algodão
• Placas de ágar Mueller-Hinton (placas de MHA)
• Caldo de MH com 50% de sangue de cavalo e 20 mg/mL β-NAD (MH-F)
• Penicilina/gentamicina de teste de e-test (ou antibióticos de interesse) (BioMerieux, Marcy l'Etoile, França, Suécia)
• Antibióticos penicilina/gentamicina (ou antibióticos de interesse (pó/solução))

Nota: As mídias específicas utilizadas para o crescimento bacteriano podem variar para diferentes espécies.