显微镜和染色：革兰克、胶囊和内孔染色

资料来源：Rhiannon M. LeVeque¹， 纳塔利娅·马丁^1，安德鲁·范阿尔斯特^1，和维克托·迪丽塔^1
1密歇根州立大学微生物学和分子遗传学系，美国密歇根州东兰辛分校

细菌是地球上几乎随处可见的各种微生物。许多特性有助于区分它们彼此，包括但不限于革兰染色类型、形状和排列、胶囊的产生和孢子的形成。为了观察这些特性，可以使用光显微镜;然而，一些细菌特性（例如尺寸、缺乏着色和折射特性）使得仅用光学显微镜（1，2）很难区分细菌。使用光显微镜区分细菌类型时，必须染色细菌。光学显微镜的两种主要类型是简单和复合的。它们之间的主要区别是用于放大物体的透镜数量。简单的显微镜（例如放大镜）只有一个镜头来放大物体，而复合显微镜有几个透镜来增强放大倍率（图1）。复合显微镜有一个接近物体的物镜，它收集光来创建物体的图像。然后，通过放大图像的目镜（目镜）放大。与单独使用单个镜头相比，将物镜和目镜相结合可实现更高的放大倍率。通常，复合显微镜具有多个不同功率的物镜，允许不同的放大倍率（1，2）。在这里，我们将讨论可视化细菌与革兰氏污渍，胶囊污渍，和内孔污渍。

图1：典型的复合显微镜。显微镜最重要的部分是标记的。

1884年由丹麦细菌学家汉斯·克里斯蒂安·格拉姆（1）开发的革兰氏染色剂根据细胞壁的组成（1，2，3，4）区分细菌。简单地说，细菌涂片被放置在显微镜幻灯片上，然后热固定，使细胞粘附在幻灯片上，使它们更容易接受污渍 （1）。热固定样品被水晶紫罗兰染色，使细胞变紫色。幻灯片用碘溶液冲洗，将水晶紫罗兰固定在细胞壁上，然后用去色剂（酒精）洗去任何非固定的水晶紫罗兰。在最后一步中，反伤，萨夫兰宁，被添加到彩色单元格红色（图2）。革兰氏阳性细菌由于厚厚的肽类层而染上紫色，而脱色剂不易渗透;革兰氏阴性细菌，其较薄的肽脂层和较高的脂质含量，与脱色剂脱色，并在添加Safranin时反染红色（图3）。革染用于将细胞区分为两种类型（革兰氏阳性和革兰氏阴性），还可用于区分细胞形状（球体或球菌、棒、弯曲棒和螺旋）和排列（单个细胞、对、链、组和簇）（1、3）.

图2：革兰染色协议的原理图。左列显示革兰氏阴性细菌在协议的每一步的反应。右列显示革兰氏阳性细菌的反应。此外，所示是两个典型的细菌细胞形状：杆菌（或棒）和球菌（或球体）。

图 3：革兰克染色结果。金黄色葡萄球菌（革联-正紫色球菌）和大肠杆菌（革兰-阴性红棒）混合物的革兰氏染色。

有些细菌产生一个细胞外粘性外层，称为胶囊（3，5）。胶囊是具有各种功能的保护结构，包括但不限于粘附表面和其他细菌、防止干燥和防止噬菌体。胶囊通常由含有95%以上水的多糖组成，但有些可能含有多醇和多胺（5）。由于其大多非离子成分和排斥污渍的倾向，简单的染色方法不适用于胶囊;相反，胶囊染色使用负染色技术，污渍细胞和背景，留下胶囊作为一个明确的光环周围的细胞（1，3）（图4）。胶囊染色涉及将细菌样品涂抹在显微镜幻灯片上的酸性污渍中。与革兰染色不同，细菌污迹在胶囊染色期间不热固定。热固定可以破坏或脱水胶囊，导致假底片 （5）。此外，热固定可以收缩细胞，导致细胞周围的清除，可以误认为胶囊，导致误报（3）。酸性污渍使滑动背景变色;而跟进一个基本的染色，水晶紫罗兰，颜色的细菌细胞本身，离开胶囊不染色，并显示为细胞和滑动背景之间的一个明确的光环（图5）。传统上，印度墨水被用作酸性污渍，因为这些颗粒不能穿透胶囊。因此，胶囊和细胞都没有被印度墨水弄脏;相反，背景被染色。刚果红，尼格罗辛，或Eosin可用于代替印度墨水。胶囊染色可以帮助医生诊断细菌感染时，从患者样本看培养物，并指导适当的患者治疗。由封装细菌引起的常见疾病包括肺炎、脑膜炎和沙门氏菌病。

图4：胶囊染色协议原理图。顶部面板显示任何污渍应用前的幻灯片涂抹。中间面板显示幻灯片和细菌如何照顾主要污渍，刚果红。最后一个面板显示幻灯片和细菌如何照顾反污渍，水晶紫罗兰。

图5：胶囊染色结果。胶囊染色的封装的阿辛托细菌鲍曼尼（用黑色箭头表示）和非封装大肠杆菌（用白色箭头表示）。请注意，背景是黑暗的，A.鲍曼尼细胞是彩色紫色的。A. baumanni细胞周围的胶囊明显是光晕，而大肠杆菌没有光晕。

在不利条件下（例如营养限制、极端温度或脱水），一些细菌产生内孢子，代谢不活性结构，对物理和化学损伤具有抵抗力（1、2、8、9）。内孢子通过保护细胞的遗传物质，使细菌在恶劣的条件下存活;一旦条件有利于生长，孢子发芽，细菌生长继续。内孢子很难用标准染色技术染色，因为它们对通常用于染色的染料是不可渗透的（1，9）。通常用来染色内皮孢子的技术是舍弗-富尔顿法（图6），它使用主要染色马拉奇特绿，水溶性污渍，结合相对较弱的细胞物质和热量，使污渍打破通过孢子皮层（图7）。这些步骤为生长的细胞（在内窥镜生物学中称为植物细胞）以及内孢子和任何游取孢子（那些不再在前细胞包络中的孢子）着色。植物细胞用水洗涤，去除马拉奇特绿;内孢子保留污渍，由于加热马拉奇特绿色在孢子内。最后，植物细胞与萨夫兰宁进行反染色以进行可视化（图8）。内孢子的染色有助于将细菌分化为孢子前体和非孢子前体，并确定样品中是否存在孢子，如果存在，则可能导致细菌在发芽时受到污染。

图6：内孔染色协议原理图。左列显示孢子形成细菌在协议的每一步的反应。右列显示非孢子形成细菌的反应。

图7：内孔结构图。含有内分孔的细菌细胞，标有各种孢子结构。

图8：内孔染色结果。亚氏杆菌内皮孢子的典型染色。植物细胞（用白色箭头表示）被染成红色，而内孢子（用黑色箭头表示）被染成绿色。