Microscopie et coloration : Gram, Capsule et endospores.

Source: Rhiannon M. LeVeque¹, Natalia Martin¹, Andrew J. Van Alst¹, et Victor J. DiRita^1
1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, East Lansing, Michigan, États-Unis d'Amérique

Les bactéries sont diverses micro-organismes que l'on trouve presque partout sur Terre. De nombreuses propriétés aident à les distinguer les unes des autres, y compris, mais sans s'y limiter, le type, la forme et l'arrangement de Gram, la production de capsules et la formation de spores. Pour observer ces propriétés, on peut utiliser la microscopie légère; cependant, certaines caractéristiques bactériennes (par exemple la taille, le manque de coloration et les propriétés réfractives) font qu'il est difficile de distinguer les bactéries uniquement avec un microscope léger (1, 2). La coloration des bactéries est nécessaire pour distinguer les types bactériens par microscopie légère. Les deux principaux types de microscopes légers sont simples et composés. La principale différence entre eux est le nombre de lentilles utilisées pour amplifier l'objet. Les microscopes simples (par exemple une loupe) n'ont qu'une lentille pour grossir un objet, tandis que les microscopes composés ont plusieurs lentilles pour améliorer le grossissement (figure 1). Les microscopes composés ont une lentille objective près de l'objet qui recueille la lumière pour créer une image de l'objet. Ceci est ensuite amplifié par l'oculaire (lentille oculaire) qui agrandit l'image. La combinaison de la lentille objective et de l'oculaire permet un grossissement plus élevé que l'utilisation d'une seule lentille. Typiquement, les microscopes composés ont plusieurs lentilles objectives de différents pouvoirs pour permettre un grossissement différent (1, 2). Ici, nous discuterons de la visualisation des bactéries avec des taches Gram, taches Capsule, et les taches Endospore.

Figure 1 : Microscope composé typique. Les parties les plus importantes du microscope sont étiquetées.

La tache Gram, développée en 1884 par le bactériologiste danois Hans Christian Gram (1), différencie les bactéries en fonction de la composition de la paroi cellulaire (1, 2, 3, 4). En bref, un frottis bactérien est placé sur une lame de microscope, puis fixé à la chaleur pour adhérer les cellules à la diapositive et les rendre plus facilement accepter des taches (1). L'échantillon fixé à la chaleur est taché de Violet de Cristal, transformant les cellules pourpres. La glissière est rincée avec une solution d'iode, qui fixe le Violet de Cristal à la paroi cellulaire, suivie d'un décoloreur (un alcool) pour laver toute violet de cristal non fixe. Dans la dernière étape, une contre-tache, Safranin, est ajoutée aux cellules de couleur rouge (figure 2). Les bactéries Gram-positives tachent le pourpre en raison de la couche épaisse de peptidoglycan qui n'est pas facilement pénétrée par le décoloreur ; Les bactéries Gram-négatives, avec leur couche peptidoglycan plus mince et leur teneur en lipides plus élevée, se décolorent avec le décolorant et sont contre-tachées en rouge lors de l'ajout de Safranin (figure 3). La coloration Gram est utilisée pour différencier les cellules en deux types (Gram-positif et Gram-négatif) et est également utile pour distinguer la forme cellulaire (sphères ou cocci, tiges, tiges courbes et spirales) et l'arrangement (cellules simples, paires, chaînes, groupes et clusters) (1, 3) .

Figure 2 : Schéma du protocole de coloration de gram. La colonne de gauche montre comment les bactéries Gram-négatives réagissent à chaque étape du protocole. La colonne de droite montre comment les bactéries Gram-positives réagissent. On y voit également deux formes de cellules bactériennes typiques : les bacilles (ou tiges) et les cocci (ou sphères).

Figure 3 : Résultats de la coloration de Gram. Une tache de Gram d'un mélange de Staphylococcus aureus (Cocci pourpre Gram-positif) et Escherichia coli (gram-négatifs tiges rouges).

Certaines bactéries produisent une couche externe visqueuse extracellulaire appelée capsule (3, 5). Les capsules sont des structures protectrices avec diverses fonctions, y compris mais sans s'y limiter à l'adhérence aux surfaces et à d'autres bactéries, à la protection contre la dessiccation et à la protection contre la phagocytose. Les capsules sont généralement composées de polysaccharides contenant plus de 95 % d'eau, mais certaines peuvent contenir des polyalcools et des polyamines (5). En raison de leur composition la plupart du temps non-ionique et de la tendance à repousser des taches, les méthodes simples de coloration ne fonctionnent pas avec la capsule ; au lieu de cela, la coloration de capsule utilise une technique négative de coloration qui tache les cellules et l'arrière-plan, laissant la capsule comme halo clair autour des cellules (1, 3) (figure 4). La coloration de capsule implique le barbouillage d'un échantillon bactérien dans une tache acide sur une glissière de microscope. Contrairement à la coloration Gram, le frottis bactérien n'est pas fixé à la chaleur lors d'une tache capsule. La fixation de la chaleur peut perturber ou déshydrater la capsule, ce qui entraîne de faux négatifs (5). En outre, la fixation de la chaleur peut rétrécir les cellules résultant en une compensation autour de la cellule qui peut être confondue comme une capsule, conduisant à de faux positifs (3). La tache acide colore le fond de diapositive ; tout en faisant un suivi avec une tache de base, Crystal Violet, colore les cellules bactériennes elles-mêmes, laissant la capsule intacte et apparaissant comme un halo clair entre les cellules et le fond de diapositive (figure 5). Traditionnellement, l'encre de L'Inde a été utilisée comme tache acide parce que ces particules ne peuvent pas pénétrer dans la capsule. Par conséquent, ni la capsule ni la cellule n'est souillée par l'encre de l'Inde; au lieu de cela, l'arrière-plan est taché. Congo Rouge, Nigrosin, ou Eosin peut être utilisé à la place de l'encre de l'Inde. La coloration des capsules peut aider les médecins à diagnostiquer les infections bactériennes lorsqu'ils examinent les cultures à partir d'échantillons de patients et à orienter le traitement approprié des patients. Les maladies courantes causées par les bactéries encapsulées comprennent la pneumonie, la méningite et la salmonellose.

Figure 4 : Schéma du protocole de coloration des capsules. Le panneau supérieur affiche le frottis de diapositive avant toute application de tache. Le panneau du milieu montre comment la diapositive et les bactéries s'occupent de la tache primaire, Congo Red. Le panneau final montre comment la diapositive et les bactéries s'occupent de la contre-tache, Crystal Violet.

Figure 5 : Résultats de la coloration des capsules. Coloration capsule d'Acinetobacter baumannii encapsulé (dénoté avec des flèches noires) et d'Escherichia coli non encapsulé (dénoté avec des flèches blanches). Notez que l'arrière-plan est sombre et que les cellules A. baumannii sont tachées de pourpre. La capsule autour des cellules A. baumannii est évidente comme un halo, tandis que E. coli n'a pas de halo.

Dans des conditions défavorables (par exemple limitation des nutriments, températures extrêmes ou déshydratation), certaines bactéries produisent des endospores, des structures métaboliquement inactives qui résistent aux dommages physiques et chimiques (1, 2, 8, 9). Les endospores permettent à la bactérie de survivre à des conditions difficiles en protégeant le matériel génétique des cellules; une fois que les conditions sont favorables à la croissance, les spores germent et la croissance bactérienne continue. Les endospores sont difficiles à tacher avec des techniques de coloration standard parce qu'elles sont imperméables aux colorants généralement utilisés pour la coloration (1, 9). La technique couramment utilisée pour tacher les endospores est la méthode Schaeffer-Fulton (figure 6), qui utilise la tache primaire Malachite Green, une tache soluble dans l'eau qui se lie relativement faiblement au matériel cellulaire, et la chaleur, pour permettre à la tache de se briser à travers le cortex de la spore (figure 7). Ces étapes colorent les cellules de plus en plus (appelées cellules végétatives dans le contexte de la biologie de l'endospore), ainsi que les endospores et les spores libres (celles qui ne se trouvent plus dans l'ancienne enveloppe cellulaire). Les cellules végétatives sont lavées à l'eau pour enlever Malachite Green; les endospores conservent la tache due au chauffage du vert de Malachite dans la spore. Enfin, les cellules végétatives sont contre-tachées avec Safranin pour visualiser (figure 8). La coloration des endospores aide à différencier les bactéries en anciens spores et en anciens non-spore, ainsi qu'à déterminer si les spores sont présentes dans un échantillon qui, s'il est présent, pourrait entraîner une contamination bactérienne lors de la germination.

Figure 6 : Schéma du Protocole de coloration endospore. La colonne de gauche montre comment les bactéries formant des spores réagissent à chaque étape du protocole. La colonne de droite montre comment les bactéries qui ne forment pas les spores réagissent.

Figure 7 : Diagramme de la structure d'Endospore. Cellule bactérienne contenant un endospore avec les diverses structures de spores étiquetées.

Figure 8 : Résultats de la coloration des endospores. Une coloration typique des endospores de Bacillus subtilis. Les cellules végétatives (démarquées par les flèches blanches) sont tachées de rouge, tandis que les endospores (dénotées avec les flèches noires) sont teintées de vert.