현미경 및 염색: 그램, 캡슐 및 내생포자 염색

출처: 리안논 M. 레베크^1,나탈리아 마틴^1,앤드류 J. 반 알스트^1,빅터 J. 디리타^1
1 미생물학 및 분자 유전학학과, 미시간 주립 대학, 이스트 랜싱, 미시간, 미국

박테리아는 지구상의 거의 모든 곳에서 발견되는 다양한 미생물입니다. 많은 속성은 그램 염색 유형, 모양 및 배열, 캡슐 생산 및 포자의 형성을 포함하되 이에 국한되지 않는 서로 구별하는 데 도움이됩니다. 이러한 특성을 관찰하기 위해, 하나는 빛 현미경 검사를 사용할 수 있습니다; 그러나, 일부 세균성 특성(예: 크기, 착색 부족 및 굴절 특성)은 빛 현미경(1, 2)으로만 박테리아를 구별하기 어렵게 만든다. 세균염색은 가벼운 현미경으로 세균성 모형을 구별할 때 필요합니다. 빛 현미경의 두 가지 주요 유형은 간단하고 화합물입니다. 그 중 가장 큰 차이점은 물체를 확대하는 데 사용되는 렌즈의 수입니다. 간단한 현미경 (예를 들어 확대 유리)에는 물체를 확대하는 렌즈가 하나뿐이지만 복합 현미경에는 배율을 높이기 위해 여러 개의 렌즈가 있습니다 (그림 1). 복합 현미경은 물체의 이미지를 만들기 위해 빛을 수집하는 물체에 가까운 객관적인 렌즈를 가지고 있습니다. 그러면 이미지를 확대하는 안구 렌즈(안구 렌즈)에 의해 확대됩니다. 객관적인 렌즈와 접안렌즈를 결합하면 단일 렌즈만 사용하는 것보다 배율이 높아질 수 있습니다. 전형적으로, 복합 현미경은 다른 배율을 허용하는 다양한 힘의 다중 객관적인 렌즈가 있습니다 (1, 2). 여기에서는 그램 얼룩, 캡슐 얼룩 및 내스포레 얼룩과 박테리아를 시각화하는 것을 논의 할 것입니다.

그림 1: 일반적인 복합 현미경. 현미경의 가장 중요한 부분은 표지됩니다.

1884년 덴마크 세균학자 한스 크리스찬 그램(1)이 개발한 그램 얼룩은 세포벽의 조성에 따라 박테리아를 분화한다(1, 2, 3, 4). 간단히 말해서, 세균성 얼룩은 현미경 슬라이드에 배치된 다음 열을 고정하여 세포를 슬라이드에 부착하고 더 쉽게 얼룩 (1)을 받아 들입니다. 열 고정 샘플은 크리스탈 바이올렛으로 염색되어 세포를 보라색으로 바꿔놓았습니다. 슬라이드는 크리스탈 바이올렛을 세포 벽에 고정시키는 요오드 용액으로 플러시되고, 디컬러라이저(알코올)가 들어와 고정되지 않은 크리스탈 바이올렛을 씻어내도록 합니다. 마지막 단계에서, 카운터스테인, 사프란, 색 세포에 빨간색(그림 2)이추가된다. 그람 양성 박테리아 얼룩 보라색 때문에 탈색제에 의해 쉽게 침투되지 않는 두꺼운 펩티도글리칸 층; 그람 음성 박테리아는 더 얇은 펩티도글리칸 층과 더 높은 지질 함량을 가지고 있으며, 탈색제로 탈염되어 사프란이 추가될 때 빨간색으로 대응된다(도 3). 그램 염색은 세포를 두 가지 유형(그램 양성 및 그람 음성)으로 분화하는 데 사용되며 세포 모양(구체 또는 코치, 막대, 곡선 막대 및 나선형) 및 배열(단일 세포, 쌍, 사슬, 그룹 및 클러스터)(1, 3)을 구별하는 데에도 유용합니다.

그림 2: 그램 염색 프로토콜의 회로도. 왼쪽 컬럼은 프로토콜의 각 단계에서 그람 음성 박테리아가 어떻게 반응하는지 보여줍니다. 오른쪽 열은 그람 양성 박테리아가 어떻게 반응하는지 보여줍니다. 또한, 도시된 두 가지 전형적인 세균성 세포 모양은 바실리(또는 막대)와 코치(또는 구)이다.

그림 3: 그램 염색 결과. 황색포도상구균(그람 양성 보라색 코치)과 에체리치아 대장균(그램 네거티브 레드 로드)의 혼합물의 그램 얼룩.

일부 박테리아는 캡슐 (3, 5)에게 불린 세포 외점성 외부 층을 생성합니다. 캡슐은 표면 및 기타 박테리아준수, 건조로부터의 보호, 식증으로부터의 보호 등 다양한 기능을 갖춘 보호 구조물입니다. 캡슐은 일반적으로 95% 이상의 물을 함유하는 다당류로 구성되어 있지만 일부는 폴리알코올과 폴리아민(5)을 함유할 수 있다. 그들의 대부분 비 이온 조성 및 얼룩을 격퇴 하는 경향으로 인해, 간단한 염색 방법은 캡슐으로 작동 하지 않습니다;; 대신, 캡슐 염색은 세포와 배경을 얼룩지게 하는 네거티브 염색 기술을 사용하여 캡슐을 세포 주위의 명확한 후광(1, 3) (도 4)로둡니다. 캡슐 염색은 현미경 슬라이드에 산성 얼룩으로 세균성 견본을 얼룩지게 관련시킵니다. 그램 염색과는 달리, 세균성 얼룩은 캡슐 얼룩 동안 열 고정되지 않습니다. 열 고정은 캡슐을 방해하거나 탈수하여 거짓 네거티브 (5)로 이어질 수 있습니다. 더욱이, 열 고정은 캡슐로 착각할 수 있는 세포 의 주위에 청산의 결과로 세포를 수축할 수 있습니다, 거짓 긍정으로 이끌어 내는 (3). 산성 얼룩은 슬라이드 배경을 색; 기본 얼룩, 크리스탈 바이올렛으로 후속 하는 동안, 크리스탈 바이올렛, 박테리아 세포 자체 색상, 캡슐을 염색 하 고 세포와 슬라이드 배경 사이 명확한 후광으로 나타나는 (그림 5). 전통적으로 인도 잉크는 이러한 입자가 캡슐을 관통할 수 없기 때문에 산성 얼룩으로 사용되어 왔습니다. 따라서 캡슐이나 세포는 인도 잉크에 의해 염색되지 않습니다. 대신 배경이 얼룩져 있습니다. 콩고 레드, 니게진, 또는 에오신은 인도 잉크 대신 사용할 수 있습니다. 캡슐 염색은 의사가 환자 샘플에서 배양을 볼 때 세균 감염을 진단하고 적절한 환자 치료를 안내하는 데 도움이 될 수 있습니다. 캡슐화된 박테리아에 기인한 일반적인 질병은 폐염, 뇌막염 및 살모넬라증을 포함합니다.

그림 4: 캡슐 염색 프로토콜의 회로도. 상단 패널은 얼룩 적용 전에 슬라이드 얼룩을 표시합니다. 중간 패널은 슬라이드와 박테리아가 기본 얼룩, 콩고 레드를 돌보는 방법을 보여줍니다. 최종 패널은 슬라이드와 박테리아가 카운터스테인 크리스탈 바이올렛을 돌보는 방법을 보여줍니다.

그림 5: 캡슐 염색 결과. 캡슐 에신에토박터 바우마니 (검은 화살로 표시) 및 비 캡슐 에체리치아 대장균 (흰색 화살표로 표시)의 캡슐 염색. 배경이 어둡고 A. 바우마니 세포는 보라색으로 얼룩져 있습니다. A. baumannii 세포 주위의 캡슐은 후광으로 분명하며 대장균에는 후광이 없습니다.

불리한 조건 (예를 들어 영양소 제한, 극한의 온도 또는 탈수)에서 일부 박테리아는 내구포를 생성하며, 신체적 및 화학적 손상에 내성이있는 대사비활성 구조 (1, 2, 8, 9). 내시경 은 박테리아가 세포의 유전 물질을 보호하여 가혹한 조건에서 살아남을 수 있도록; 일단 조건이 성장에 유리한, 포자 발화, 그리고 세균성 성장은 계속합니다. 내시경은 일반적으로 염색에 사용되는 염료에 침투할 수 없기 때문에 표준 염색 기술로 얼룩이 되기 어렵다(1, 9). 내측 포자를 염색하는 데 일상적으로 사용되는 기술은 Schaeffer-Fulton 방법 (도 6)으로,1 차 적인 얼룩 말라카이트 그린을 사용하는, 세포 물질및 열에 상대적으로 약하게 결합하는 수용성 얼룩, 그리고 열, 얼룩이 포자의 피질을 통해 돌파 할 수 있도록 (도 7). 이 단계는 성장하는 세포 (내시경 생물학의 맥락에서 식물 세포라고 불려짐), 내포및 모든 무료 포자 (더 이상 이전 세포 봉투 내에서)를 색을 물고 있습니다. 식물 세포는 말라카이트 그린을 제거하기 위해 물로 세척됩니다. 내포는 포자 내에서 말라카이트 그린을 가열하기 때문에 얼룩을 유지합니다. 마지막으로 식물 세포는 사프란과 함께 비색된다(그림 8). 내시경 포자에 대한 염색은 포자 전자와 비 포자 전자로 박테리아를 분화하는 데 도움이뿐만 아니라, 포자가 샘플에 존재하는지 여부를 결정, 존재하는 경우, 발아시 세균 성 오염으로 이어질 수 있습니다.

그림 6: 내시경 염색 프로토콜의 회로도. 왼쪽 컬럼은 포자 형성 박테리아가 프로토콜의 각 단계에서 어떻게 반응하는지 보여줍니다. 오른쪽 열은 비 포자 형성 박테리아가 반응하는 방법을 보여줍니다.

그림 7: 내시경 구조의 다이어그램. 표지된 각종 포자 구조물을 가진 내시경을 포함하는 세균성 세포.

그림 8: 내시경 염색 결과. 바실러스 서브틸리스의내분포의 전형적인 염색. 식물 세포 (흰색 화살표로 표시)는 빨간색으로 얼룩지고 내시경포기 (검은 화살표로 표시)는 녹색으로 얼룩져 있습니다.