Konjugation: Eine Methode zur Übertragung der Ampicillinresistenz vom Spender auf den Empfänger E. coli

Quelle: Alexander S. Gold¹, Tonya M. Colpitts^1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases Laboratories, Boston, MA

Erstmals 1946 von Lederberg und Tatum entdeckt, ist die Konjugation eine Form des horizontalen Gentransfers zwischen Bakterien, die auf direkten physischen Kontakt zwischen zwei Bakterienzellen beruht (1). Im Gegensatz zu anderen Formen des Gentransfers, wie Transformation oder Transduktion, ist konjugation ein natürlich vorkommender Prozess, bei dem DNA unidirektional von einer Spenderzelle in eine Empfängerzelle abgesondert wird. Diese Richtung und die Fähigkeit für diesen Prozess, die genetische Vielfalt von Bakterien zu erhöhen, hat der Konjugation den Ruf als eine Form der bakteriellen "Paarung" verliehen, von der angenommen wird, dass sie wesentlich zum jüngsten Anstieg der antibiotikaresistenten Bakterien (2, 3). Durch den Einsatz selektiver Drücke, z. B. durch den Einsatz von Antibiotika, wurde die Konjugation für den Einsatz im Labor manipuliert, was sie zu einem leistungsfähigen Werkzeug für den horizontalen Gentransfer zwischen Bakterien und in einigen Fällen von Bakterien auf Hefe, Pflanze und Tier macht. Zellen (4). Neben Anwendungen im Labor ist der Bakterielle-Eukaryote-Gentransfer durch Konjugation ein spannender Weg des DNA-Transfers mit einer Vielzahl möglicher biotechnischer Anwendungen und natürlich vorkommender Implikationen (5).

Die Konjugation wird vermutlich durch einen "zweistufigen Mechanismus" (6) funktioniert. Erstens muss die Spenderzelle, bevor dna übertragen werden kann, direkten Zell-zu-Zell-Kontakt mit dem Empfänger herstellen. Dieser Prozess wurde am besten in gram-negativen Bakterien charakterisiert, von denen die am meisten untersuchten Escherichia coliist. Der Zell-zu-Zell-Kontakt wird durch das Vorhandensein eines komplexen Netzes extrazellulärer Filamente auf dem Spender hergestellt, der als Geschlechtspilus bekannt ist, ein konjugatives Element, das durch das übertragbare Gen kodiert wird, das als F-Faktor (Fruchtbarkeit) (7, 8) bezeichnet wird. Neben der Herstellung eines Kontakts zwischen Spender und Empfänger werden mehrere Proteine über den Geschlechtspilus zum Empfängerzytoplasma transportiert, wodurch ein Typ-IV-Sekretionssystem (T4SS) zwischen den beiden Zellen gebildet wird, eine notwendige Struktur für den zweiten Schritt der Konjugation, DNA-Transfer (6). Durch die Kombination dieser Funktion des Geschlechtspilus mit der Rollkreisreplikation der DNA ist die Spenderzelle in der Lage, DNA in Form eines transponierbaren Elements, wie eines Plasmids oder Transposons, durch ein "Shoot and Pump"-Modell (6) an den Empfänger zu übertragen. In diesem Fall ist das "Schießen" der Transport des Pilotproteins mit verknüpfter DNA durch das T4SS in die Empfängerzelle, und das "Pumpen" ist der aktive Transport von DNA zum Empfänger, ein Prozess, der vom T4SS abhängig ist und durch Kopplungsproteine katalysiert wird (6). Die in diesem Verfahren verwendete Maschinerie besteht aus einem Ursprung der Übertragungssequenz (oriT), die von der DNA in cis und trans-Genen bereitgestellt werden muss, die eine Relaxase, paarpaarbildung Komplex und Typ IV Kopplungsprotein kodieren, und kann in cis oder trans (9) vorhanden sein. Diese Relaxase spaltet die nic-Site innerhalb der OriT-Sequenz und heftet sich kovalent am 5' Ende des übertragenen Strangs an, um das Relaxosome zu produzieren, einen einsträngigen DNA-Relaxase-Komplex mit anderen Hilfsproteinen (9). Nach der Bildung verbindet sich das Relaxosom über das Kopplungsprotein Typ IV mit dem Paarungskomplex typ IV, das die Übertragung des ssDNA-Relaxase-Komplexes in Empfängerzellen durch den T4SS (10) ermöglicht. Einmal im Zytoplasma des Empfängers, kann sich die DNA in das Empfängergenom integrieren oder separat in Form eines Plasmids existieren, von denen beide die Expression ihrer Gene ermöglichen.

In diesem Experiment wurde der weit verbreitete Konjugationsspenderstamm E. coli WM3064 verwendet, um das Gen zur Ampicillinresistenz auf den Empfängerstamm E. coli J53 zu übertragen. Während beide Stämme der gramnegativen Bakterien gegen Tetracyclin resistent waren, hatte nur der Spenderstamm WM3064 das Gen für Ampicillinresistenz, für den im pWD2-oriT-Shuttlevektor kodiert, und war auxotroph bis Diaminopimelsäure (DAP) (11-13). Dieses Experiment bestand aus zwei Hauptschritten, der Vorbereitung von Spender- und Empfängerstämmen, gefolgt von der Übertragung des Ampicillinresistenzgens vom Spender zum Empfänger durch Konjugation (Abbildung 1).

Abbildung 1: Konjugationsschema. Dieser Schaltplan zeigt die erfolgreiche Übertragung eines Plasmids, nur ein Beispiel für ein transposierbares DNA-Element, von einer Spenderzelle zu einer Empfängerzelle mittels Konjugation. Bei Kontakt mit der Empfängerzelle durch die Spenderzelle über den Sexpilus repliziert sich das Plasmid durch Rollenkreisreplikation, bewegt sich durch den Multiproteinkomplex, der die beiden Zellen verbindet, und bildet ein neues vollwertiges Plasmid in der Empfängerzelle.

Durch die Inkubation einer Mischung aus Spender- und Empfängerzellen, die diese Zellen sukzessive in Gegenwart von Tetracyclin und DAP plattiert, ermöglichte dies die erfolgreiche Übertragung des Ampicillinresistenzgens. Nacheinander wurden Zellen, die aus dieser Mischung in Gegenwart von Tetracyclin und Ampicillin auswachsen, entfernt, alle Spenderzellen aufgrund des Mangels an DAP und alle Empfängerzellen entfernt, die möglicherweise nicht das Ampicillin-Resistenzgen gewonnen haben, was streng Empfänger-J53-Stamm ergibt. Bakterien, die ampicillinResistenz erworben haben (Abbildung 2). Nach der Durchführung wurde die erfolgreiche Übertragung des Ampicillinresistenzgens durch PCR bestätigt. Da die Konjugation erfolgreich war, enthielt der J53-Stamm von E. coli pWD2-oriT und war resistent gegen Ampicillin, und die Genkodierung für diese Resistenz ist durch PCR nachweisbar. Bei erfolglosem Erfolg hätte es jedoch keinen Nachweis des Ampicillinresistenzgens gegeben und Ampicillin würde immer noch als wirksames Antibiotikum gegen den J53-Stamm funktionieren.

Abbildung 2: Protokollschema. Dieser Schaltplan zeigt eine Übersicht über das vorgestellte Protokoll.

Abbildung 3A: Die Bestätigung einer erfolgreichen Konjugation durch PCR. A) Die Gefrierbestände der konjugierten und negativen Kontrollproben wurden auf Agarplatten ausgestreift und eine Kolonie (rot) für die DNA-Isolierung ausgewählt.