Coniugazione: un metodo per trasferire la resistenza all'ampicillina dal donatore al ricevente E. coli

Fonte: Alexander S. Gold¹, Tonya M. Colpitts^1
1 Dipartimento di Microbiologia, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases Laboratories, Boston, MA

Scoperta per la prima volta da Lederberg e Tatum nel 1946, la coniugazione è una forma di trasferimento genico orizzontale tra batteri che si basa sul contatto fisico diretto tra due cellule batteriche (1). A differenza di altre forme di trasferimento genico, come la trasformazione o la trasduzione, la coniugazione è un processo naturale in cui il DNA viene secreto da una cellula donatrice a una cellula ricevente in modo unidirezionale. Questa direzionalità e la capacità di questo processo di aumentare la diversità genetica dei batteri ha dato alla coniugazione la reputazione di una forma di "accoppiamento" batterico, che si ritiene abbia contribuito notevolmente al recente aumento dei batteri resistenti agli antibiotici (2, 3). Utilizzando pressioni selettive, ad esempio l'uso di antibiotici, la coniugazione è stata manipolata per l'uso in laboratorio, rendendola un potente strumento per il trasferimento genico orizzontale tra batteri e, in alcuni casi, da batteri a lieviti, cellule vegetali e animali (4). Oltre alle applicazioni in laboratorio, il trasferimento genico batterio-eucariota mediante coniugazione è un'entusiasmante via di trasferimento del DNA con una moltitudine di possibili applicazioni biotecniche e implicazioni naturali (5).

Si pensa che la coniugazione funzioni con un "meccanismo a due fasi" (6). In primo luogo, prima che qualsiasi DNA possa essere trasferito, la cellula donatrice deve entrare in contatto diretto cellula a cellula con il ricevente. Questo processo è stato caratterizzato meglio nei batteri gram-negativi, il più studiato dei quali è Escherichia coli. Il contatto cellula-cellula è stabilito dalla presenza di una complessa rete di filamenti extracellulari sul donatore nota come sex pilus, un elemento coniugativo codificato dal gene trasferibile noto come fattore F (fertilità) (7, 8). Oltre a stabilire un contatto tra donatore e ricevente, diverse proteine vengono trasportate attraverso il pilus sessuale al citoplasma ricevente, formando un condotto del sistema di secrezione di tipo IV (T4SS) tra le due cellule, una struttura necessaria per la seconda fase di coniugazione, il trasferimento del DNA (6). Combinando questa funzione del pilus sessuale con la replicazione del cerchio rotolante del DNA, la cellula donatrice è in grado di trasferire il DNA sotto forma di un elemento trasponibile, come un plasmide o un trasposone, al ricevente mediante un modello "shoot and pump" (6). In questo caso, lo "shooting" è il trasporto della proteina pilota, con DNA collegato, da parte del T4SS nella cellula ricevente, e il "pumping" è il trasporto attivo del DNA al ricevente, un processo dipendente dal T4SS e catalizzato dall'accoppiamento delle proteine (6). Il macchinario utilizzato in questo processo è composto da un'origine di sequenza di trasferimento (oriT), che deve essere fornita dal DNA nei geni cis e trans, che codificano una relaxasi, un complesso di formazione di coppie di accoppiamenti e una proteina di accoppiamento di tipo IV, e possono essere presenti in cis o trans (9). Questa relaxasi fende il sito nic all'interno della sequenza oriT e si attacca covalentemente all'estremità 5' del filamento trasferito per produrre il relaxosoma, un complesso DNA-relaxasi a singolo filamento con altre proteine ausiliarie (9). Una volta formato, il relaxosoma si collega al complesso di formazione della coppia di accoppiamento, tramite la proteina di accoppiamento di tipo IV, che consente il trasferimento del complesso ssDNA-relaxasi nelle cellule riceventi da parte del T4SS (10). Una volta nel citoplasma del ricevente, il DNA può integrarsi nel genoma del ricevente o esistere separatamente sotto forma di plasmide, entrambi i quali consentono l'espressione dei suoi geni.

In questo esperimento, il ceppo di donatore di coniugazione ampiamente utilizzato E. coli WM3064 è stato utilizzato per trasferire il gene che codifica per la resistenza all'ampicillina al ceppo ricevente E. coli J53. Mentre entrambi i ceppi dei batteri gram-negativi erano resistenti alla tetraciclina, solo il ceppo donatore WM3064 aveva il gene per la resistenza all'ampicillina, codificato per nel vettore navetta pWD2-oriT, ed era auxotrofico all'acido diaminopimetico (DAP) (11-13). Questo esperimento consisteva in due fasi principali, la preparazione di ceppi donatore e ricevente, seguita dal trasferimento del gene di resistenza all'ampicillina dal donatore al ricevente mediante coniugazione (Figura 1).

Figura 1: Schema di coniugazione. Questo schema mostra il successo del trasferimento di un plasmide, solo un esempio di elemento di DNA trasponibile, da una cellula donatrice a una cellula ricevente usando la coniugazione. Al contatto con la cellula ricevente da parte della cellula donatrice attraverso il pilus sessuale, il plasmide si replica mediante replicazione del cerchio rotolante, si muove attraverso il complesso multiproteico unendo le due cellule e forma un nuovo plasmide a lunghezza intera nella cellula ricevente.

Incubando una miscela di cellule donatrici e riceventi, quindi placcando successivamente queste cellule in presenza di tetraciclina e DAP, ciò ha permesso il trasferimento riuscito del gene di resistenza all'ampicillina. Successivamente, le cellule placcate cresciute da questa miscela in presenza di tetraciclina e ampicillina, hanno rimosso tutte le cellule donatrici a causa della mancanza di DAP e di eventuali cellule riceventi che potrebbero non aver acquisito il gene di resistenza all'ampicillina, producendo batteri del ceppo J53 strettamente riceventi che hanno acquisito resistenza all'ampicillina (Figura 2). Una volta effettuato, il successo del trasferimento del gene di resistenza all'ampicillina è stato confermato dalla PCR. Poiché la coniugazione ha avuto successo, il ceppo J53 di E. coli conteneva pWD2-oriT ed era resistente all'ampicillina, e il gene che codifica per questa resistenza è rilevabile dalla PCR. Tuttavia, in caso di insuccestamento non ci sarebbe stato alcun rilevamento del gene di resistenza all'ampicillina e l'ampicillina avrebbe comunque funzionato come un antibiotico efficace contro il ceppo J53.

Figura 2: Schema del protocollo. Questo schema mostra una panoramica del protocollo presentato.

Figura 3A: La conferma del successo della coniugazione mediante PCR. A) Le scorte congelatrici dei campioni di controllo coniugati e negativi sono state strisciate su piastre di agar e una colonia è stata selezionata (rossa) per l'isolamento del DNA.