접합: 공여 E.coli에서 수용 E.coli로 암피실린 내성을 전달하는 방법

출처: 알렉산더 S. 골드¹, 토냐 M. 콜핏스^1
1 미생물학학과, 보스턴 대학교 의과대학, 국립 신흥 감염 질병 연구소, 보스턴, MA

1946년 Lederberg와 테이텀에 의해 처음 발견된, 결합은 두 개의 세균세포(1)의 직접적인 물리적 접촉에 의존하는 박테리아 간의 수평 유전자 전달의 한 형태이다. 변형 이나 트랜스포션과 같은 다른 형태의 유전자 전달과 달리, 컨쥬게이션은 DNA가 기증자 세포에서 단방향 방식으로 받는 세포로 분비되는 자연발생 적인 과정입니다. 이러한 방향성 및 박테리아의 유전적 다양성을 증가시키는 이 과정에 대한 능력은 최근 항생제 내성 박테리아(2, 3)의 상승에 크게 기여한 것으로 여겨지는 세균성 "짝짓기"의 한 형태로 명성을 얻었습니다. 선택적 압력을 이용하여, 예를 들어 항생제의 사용, 결합은 실험실 환경에서 사용하기 위해 조작되어 박테리아 간의 수평 유전자 전달을 위한 강력한 도구이며, 어떤 경우에는 박테리아에서 효모, 식물 및 동물 세포(4)로 균계로 이동한다. 실험실에서 응용 프로그램 외에도, 균-진핵생물 유전자 전달 은 가능한 생체 공학 응용 및 자연 발생 의미 (5)의 무리와 DNA 전송의 흥미로운 경로입니다.

컨쥬게이션은 "2단계 메커니즘"(6)에 의해 작동하도록 생각됩니다. 첫째, 어떤 DNA든지 전송될 수 있기 전에, 기증자 세포는 수령인과 직접 세포 대 세포 접촉을 해야 합니다. 이 과정은 그람 음성 박테리아에서 가장 잘 특징지어졌으며, 가장 많이 연구된 것은 대장균이다. 세포-세포 접촉은 F(불임) 인자(7, 8)로 알려진 전달 가능한 유전자에 의해 인코딩된 유도체인 성필루스로 알려진 기증자에 세포외 필라멘트의 복잡한 네트워크의 존재에 의해 확립된다. 기증자와 수령인 간의 접촉을 확립하는 것 외에도, 여러 단백질은 성필루스를 통해 받는 자 세포질로 이송되어 두 세포 사이에 형 IV 분비 시스템(T4SS) 도관을 형성하며, 2차 컨쥬게이션, DNA 전달(6)에 필요한 구조이다. 성필루의 이러한 기능을 DNA의 롤링 원 복제와 결합함으로써, 기증자 세포는 플라스미드 또는 트랜스포슨과 같은 형질전환 가능한 요소의 형태로 DNA를 "촬영 및 펌프" 모델(6)에 의해 받는 사람에게 전달할 수 있다. 이 경우, "사격"은 시험 단백질의 수송이며, 연결된 DNA를 가진, T4SS에 의해 수신자 세포로, 그리고 "펌핑"은 수신자에게 DNA의 활성 수송, T4SSS에 의존하는 과정및 결합 단백질(6)에 의해 촉매된다. 이 과정에 사용되는 기계는 시스 및 트랜스 유전자의 DNA에 의해 제공되어야 하는 전사 서열(oriT)의 기원으로 구성되며, 이는 이완제, 짝짝 쌍 형성 복합체 및 타입 IV 커플링 단백질을 인코딩하고 시스 또는 트랜스(9)에 존재할 수 있다. 이 릴렉스아제는 오리T 서열 내에서 닉 사이트를 갈라놓고 다른 보조 단백질 (9)과 함께 단일 가닥 DNA 이완제 복합체인 이완을 생성하기 위해 전달된 가닥의 5'말에 공유적으로 부착합니다. 일단 형성되면, 이완성은 T4SS (10)에 의해 수신자 세포로 ssDNA-relaxase 복합체의 전송을 허용하는 타입 IV 커플링 단백질을 통해 결합 쌍 형성 복합체에 연결합니다. 일단 수령인의 세포질에서, DNA는 수신자 게놈으로 통합하거나 그것의 유전자의 발현을 허용하는 플라스미드의 양식에서 별도로 존재할 수 있습니다.

본 실험에서, 널리 사용되는 유도균 균주 대장균 WM3064는 수취인균 균주 E. coli J53에 ampicillin 내성을 위한 유전자 인코딩을 전송하는 데 사용되었다. 그람 음성 박테리아의 두 변종은 테트라사이클린에 저항하는 동안, 만 기증자 균주 WM3064는 ampicillin 저항을 위한 유전자를 가지고, pWD2-oriT 셔틀 벡터에 대한 인코딩, 및 diaminopimelic 산 (DAP)에 보조 trophic이었다 (11-13). 본 실험은 두 가지 주요 단계, 기증자 및 수령인 균주의 제제, 유도체에서 양수로 암피실린 저항 유전자의 전송으로 구성하였다(도 1).

그림 1: 컨쥬게이션 회로도. 이 회로도는 골치를 이용한 기증자 세포에서 수신자 세포로 의한 전형 가능한 DNA 요소의 단 하나의 예인 플라스미드의 성공적인 전달을 보여줍니다. 성별 필러스를 통해 기증자 세포에 의해 받는 사람 세포와 접촉하면, 플라스미드는 롤링 원 복제에 의해 복제되고, 두 세포에 결합하는 다단백 복합체를 통해 이동하고, 받는 사람 세포에 새로운 전체 길이 플라스미드를 형성한다.

기증자와 수령인 세포의 혼합물을 배양함으로써 테트라사이클린과 DAP의 존재속에서 이러한 세포를 연속적으로 도금함으로써, 이것은 암피실린 저항 유전자의 성공적인 전달을 허용했다. 테트라사이클린과 암피실린이 존재하여 이 혼합물에서 자라는 세포는, 증폭균 저항 유전자를 얻지 못했을 수 있는 DAP 및 수신자 세포의 부족으로 인해 모든 기증자 세포를 제거하여 암피실린 저항성을 획득한 J53 균주 균을 엄격하게 산출하였다(도 2). 일단 수행되면, 암피실린 저항 유전자의 성공적인 전송은 PCR에 의해 확인되었다. 인쥬게이션이 성공했기 때문에 대장균의 J53 균주는 pWD2-oriT를 함유하고 암피실린에 내성이 있었으며, 이러한 저항을 위한 유전자 인코딩은 PCR에 의해 검출될 수 있다. 그러나, 성공하지 못하면 암피실린 저항 유전자의 검출이 없었을 것이고 암피실린은 여전히 J53 균주에 대한 효과적인 항생제로 기능할 것이다.

그림 2: 프로토콜 회로도. 이 회로도는 제시된 프로토콜에 대한 개요를 보여 주어 있습니다.

그림 3A: PCR에 의한 성공적인 컨쥬게이션의 확인. A) 컨쥬게이트 및 음극식 샘플의 냉동고 주식이 천판에 줄지어 서 있었고, DNA 절연을 위해 콜로니가 선택되었다(빨강).