Phagen-Transduktion: Eine Methode zur Übertragung der Ampicillinresistenz von einem Spender auf den Empfänger E. coli

Quelle: Alexander S. Gold¹, Tonya M. Colpitts^1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases Laboratories, Boston, MA

Transduktion ist eine Form des genetischen Austauschs zwischen Bakterien, die Bakteriophagen oder Phagen verwenden, eine Klasse von Viren, die ausschließlich prokaryotische Organismen infiziert. Diese Form der DNA-Übertragung, von einem Bakterium zum anderen durch einen Phagen, wurde 1951 von Norton Zinder und Joshua Ledererg entdeckt, die den Prozess als "Transduktion" bezeichneten (1). Bakteriophagen wurden erstmals 1915 vom britischen Bakteriologen Frederick Twort entdeckt, 1917 vom französisch-kanadischen Mikrobiologen Felix d'Herelle (2) selbstständig wieder entdeckt. Seitdem sind die Struktur und Funktion dieser Phagen weithin charakterisiert (3), wodurch diese Phagen in zwei Klassen unterteilt wurden. Die erste dieser Klassen sind die lytischen Phagen, die sich bei einer Infektion innerhalb des Wirtsbakteriums vermehren, den bakteriellen Stoffwechsel stören, die Zelle lysieren und Nachkommenphagen freisetzen (4). Als Ergebnis dieser antibakteriellen Aktivität und der zunehmenden Prävalenz antibiotikaresistenter Bakterien haben sich diese lytischen Phagen in letzter Zeit als Ersatzbehandlung für Antibiotika erwiesen. Die zweite dieser Klassen sind die lysogene Phagen, die sich entweder innerhalb des Wirts über den lytischen Zyklus vermehren können oder in einen ruhestillenden Zustand eintreten, in dem ihr Genom in das des Wirts integriert ist (Abbildung 1), ein Prozess, der als Lysogenie bekannt ist, mit der Fähigkeit für Phagen Produktion in mehreren späteren Generationen induziert werden (4).

Abbildung 1: Infektion der Wirtszelle durch Bakteriophagen. Adsorption durch den Phagen an die bakterielle Zellwand über Wechselwirkungen zwischen den Schwanzfasern und dem Rezeptor (lila). Einmal auf der Zelloberfläche angekommen, wird der Phagen irreversibel mit der Grundplatte (schwarz) an der Bakterienzelle befestigt, die durch den kontraktilen Mantel (gelb) zur Zellwand bewegt wird. Das Phage-Genom (rot) gelangt dann in die Zelle und integriert sich in das Genom der Wirtszelle.

Während bakterielle Transduktion ein natürlich vorkommender Prozess ist, wurde sie mit moderner Technologie für den Transfer von Genen in Bakterien im Labor verfahren. Durch das Einfügen von Genen von Interesse in das Genom eines lysogenen Phagens, wie Phagen, ist man in der Lage, diese Gene in die Genome von Bakterien zu übertragen und folglich innerhalb dieser Zellen auszudrücken. Während andere Methoden des Gentransfers, wie die Transformation, ein Plasmid für Gentransfer und Expression verwenden, hat die Einfügung des Phagengenoms in das des Empfängerbakteriums nicht nur das Potenzial, diesem Bakterium neue Merkmale zu verleihen, sondern ermöglicht auch natürlich vorkommende Mutationen und andere Faktoren der zellulären Umgebung, um die Funktion des übertragenen Gens zu verändern.

Im Vergleich zu anderen Methoden des horizontalen Gentransfers, wie z. B. Konjugation, ist die Transduktion in den Kriterien, die für Spender- und Empfängerzellen erforderlich sind, ziemlich flexibel. Jedes genetische Element, das in das Genom des verwendeten Phagens passen kann, kann von jedem Stamm von Spenderbakterien auf jeden Stamm von Empfängerbakterien übertragen werden, solange beide für den Phagen freisind, was die Expression der notwendigen Phagenrezeptoren auf der Zelloberflächen. Sobald dieses Gen aus dem Spendergenom herausgebracht und in den Phagen verpackt ist, kann es an den Empfänger übertragen werden. Nach der Transduktion ist es notwendig, für EmpfängerBakterien auszuwählen, die das Gen von Interesse enthalten, für die ausgewählt werden muss. Dies könnte durch die Verwendung eines genetischen Markers, wie z. B. eines FLAG-Tags oder Polyhistidin-Tags, erfolgen, um das Gen von Interesse oder die intrinsische Funktion des Gens im Falle von Genen zu kennzeichnen, die für Antibiotikaresistenzen kodieren. Darüber hinaus könnte PCR verwendet werden, um eine erfolgreiche Transduktion weiter zu bestätigen. Durch die Verwendung von Primern für eine Region innerhalb des Gens von Interesse und den Vergleich von Signal enden mit einer positiven Kontrolle, Bakterien, die das Gen von Interesse haben, und einer negativen Kontrolle, Bakterien, die die gleichen Schritte wie die Transduktionsreaktion ohne Phagen durchliefen. Während die bakterielle Transduktion ein nützliches Werkzeug in der Molekularbiologie ist, spielt sie eine wichtige Rolle bei der Evolution von Bakterien, insbesondere im Hinblick auf den jüngsten Anstieg der Antibiotikaresistenz.

In diesem Experiment wurde die bakterielle Transduktion verwendet, um die Genkodierung für die Resistenz gegen das Antibiotikum Ampicillin vom W3110-Stamm von E.coli auf den J53-Stamm über das P1-Bakteriophagen (5) zu übertragen. Dieses Experiment bestand aus zwei Hauptschritten. Erstens die Herstellung von P1-Phagen, das das Ampicillin-Resistenzgen aus dem Spenderstamm enthält. Zweitens die Übertragung dieses Gens auf den Empfängerstamm durch Transduktion mit dem P1-Phagen (Abbildung 1). Nach der Durchführung konnte die erfolgreiche Übertragung des Ampicillinresistenzgens durch qPCR bestimmt werden (Abbildung 2). Wenn die Transduktion erfolgreich wäre, wäre der J53-Stamm von E. coli resistent gegen Ampicillin und das Gen, das diese Resistenz durch qPCR nachweisbar macht. Bei einem Erfolglosen würde es keinen Nachweis des Ampicillinresistenzgens geben und Ampicillin würde immer noch als wirksames Antibiotikum gegen den J53-Stamm wirken.

Abbildung 2: Bestätigung einer erfolgreichen Transduktion durch qPCR. Durch den Vergleich der C q-Werte, die für das Gen von Interesse aus der Transduktionsreaktion und der Negativkontrollreaktion nachgewiesen wurden, und die Normalisierung dieser Werte mit einem Housekeeping-Gen konnte man bestätigen, dass die bakterielle Transduktion erfolgreich war.