La trasduzione batterica tramite fagi: un metodo per trasferire la resistenza all'ampicillina da una cellula donatore di E. coli ad una ricevente

Fonte: Alexander S. Gold¹, Tonya M. Colpitts^1
1 Dipartimento di Microbiologia, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases Laboratories, Boston, MA

La trasduzione è una forma di scambio genetico tra batteri che utilizza batteriofagi, o fagi, una classe di virus che infetta esclusivamente organismi procariotici. Questa forma di trasferimento del DNA, da un batterio all'altro attraverso un fago, fu scoperta nel 1951 da Norton Zinder e Joshua Ledererg, che definirono il processo "trasduzione" (1). I batteriofagi furono scoperti per la prima volta nel 1915 dal batteriologo britannico Frederick Twort, poi scoperti indipendentemente nel 1917 dal microbiologo franco-canadese Felix d'Herelle (2). Da allora, la struttura e la funzione di questi fagi sono state ampiamente caratterizzate (3), dividendo questi fagi in due classi. La prima di queste classi sono i fagi litici che al momento dell'infezione si moltiplicano all'interno del batterio ospite, interrompendo il metabolismo batterico, lisi della cellula e rilasciando fagi di progenie (4). Come risultato di questa attività antibatterica e della crescente prevalenza di batteri resistenti agli antibiotici, questi fagi litici si sono recentemente dimostrati utili come trattamento sostitutivo degli antibiotici. La seconda di queste classi sono i fagi lisogenici che possono moltiplicarsi all'interno dell'ospite attraverso il ciclo litico o entrare in uno stato quiescente in cui il loro genoma è integrato in quello dell'ospite (Figura 1), un processo noto come lisogenesi, con la capacità di indotta dalla produzione di fagi in più generazioni successive (4).

Figura 1: Infezione della cellula ospite da parte del batteriofago. Adsorbimento da parte del fago alla parete cellulare batterica attraverso interazioni tra le fibre della coda e il recettore (viola). Una volta sulla superficie cellulare, il fago viene irreversibilmente attaccato alla cellula batterica usando la piastra di base (nera) che viene spostata sulla parete cellulare dalla guaine contrattile (gialla). Il genoma dei fagi (rosso) entra quindi nella cellula e si integra nel genoma della cellula ospite.

Mentre la trasduzione batterica è un processo naturale, utilizzando la tecnologia moderna è stata manipolata per il trasferimento di geni nei batteri in laboratorio. Inserendo geni di interesse nel genoma di un fago lisogenico, come il fago, si è in grado di trasferire questi geni nei genomi dei batteri e di conseguenza esprimerli all'interno di queste cellule. Mentre altri metodi di trasferimento genico, come la trasformazione, utilizzano un plasmide per il trasferimento e l'espressione genica, l'inserimento del genoma del fago in quello del batterio ricevente non solo ha il potenziale per conferire nuovi tratti a questo batterio, ma consente anche mutazioni naturali e altri fattori dell'ambiente cellulare per alterare la funzione del gene trasferito.

Rispetto ad altri metodi di trasferimento genico orizzontale, come la coniugazione, la trasduzione è abbastanza flessibile nei criteri richiesti per le cellule donatrici e riceventi. Qualsiasi elemento genetico che può adattarsi all'interno del genoma del fago utilizzato può essere trasferito da qualsiasi ceppo di batteri donatori a qualsiasi ceppo di batteri riceventi purché entrambi siano permissivi al fago, richiedendo l'espressione dei necessari recettori fagici sulle superfici cellulari. Una volta che questo gene viene spostato fuori dal genoma del donatore e confezionato nel fago, può essere trasferito al ricevente. Dopo la trasduzione, è necessario selezionare per i batteri riceventi che contengono il gene di interesse devono essere selezionati per. Questo potrebbe essere fatto utilizzando un marcatore genetico, come un FLAG-tag o un polyhistidine-tag, per contrassegnare il gene di interesse, o la funzione intrinseca del gene, nel caso di geni che codificano per la resistenza agli antibiotici. Inoltre, la PCR potrebbe essere utilizzata per confermare ulteriormente il successo della trasduzione. Utilizzando primer per una regione all'interno del gene di interesse e confrontando il segnale con un controllo positivo, batteri che hanno il gene di interesse e un controllo negativo, batteri che hanno subito gli stessi passaggi della reazione di trasduzione senza fagi. Mentre la trasduzione batterica è uno strumento utile in biologia molecolare, ha e continua a svolgere un ruolo importante nell'evoluzione dei batteri, in particolare per quanto riguarda il recente aumento della resistenza agli antibiotici.

In questo esperimento, la trasduzione batterica è stata utilizzata per trasferire il gene che codifica per la resistenza all'ampicillina antibiotica dal ceppo W3110 di E.coli al ceppo J53 attraverso il batteriofago P1 (5). Questo esperimento consisteva in due fasi principali. In primo luogo, la preparazione del fago P1 contenente il gene di resistenza all'ampicillina dal ceppo donatore. In secondo luogo, il trasferimento di questo gene al ceppo ricevente per trasduzione con il fago P1 (Figura 1). Una volta effettuato, il successo del trasferimento del gene di resistenza all'ampicillina potrebbe essere determinato dalla qPCR (Figura 2). Se la trasduzione ha successo, il ceppo J53 di E. coli sarebbe resistente all'ampicillina e il gene che conferisce questa resistenza rilevabile dalla qPCR. In caso di insuccesta, non ci sarebbe alcun rilevamento del gene di resistenza all'ampicillina e l'ampicillina funzionerebbe ancora come un antibiotico efficace contro il ceppo J53.

Figura 2: La conferma del successo della trasduzione da parte della qPCR. Confrontando i valori di C_q rilevati per il gene di interesse dalla reazione di trasduzione e dalla reazione di controllo negativa e normalizzando questi valori con un gene di pulizia, si è stati in grado di confermare che la trasduzione batterica ha avuto successo.