ファージトランスダクション:アンピシリン耐性をドナーからレシピエント大腸菌に伝達する方法

ソース: アレクサンダー S. ゴールド¹, トーニャ M. コルピッツ^1
1ボストン大学医学部微生物学科、国立新興感染症研究所、ボストン、マサチューセッツ州

トランスダクションは、バクテリオファージ(ファージ)を利用する細菌間の遺伝的交換の一形態であり、原核生物に排他的に感染するウイルスのクラスである。この形態のDNA移動は、ファージを通じてある細菌から別の細菌に移り、1951年にノートン・ジンダーとジョシュア・レデレルグによって発見された(1)。バクテリオファージは1915年に英国の細菌学者フレデリック・ツールトによって最初に発見され、その後1917年にフランス系カナダ人の微生物学者フェリックス・デレル(2)によって再び発見された。それ以来、これらのファージの構造と機能は広く特徴付けられており(3)、これらのファージを2つのクラスに分割する。これらのクラスの最初のクラスは、感染時に宿主細菌内で増殖し、細菌代謝を破壊し、細胞を溶解し、子孫ファージを放出する溶解ファージである(4)。この抗菌活性と抗生物質耐性細菌の有病率の増加の結果として、これらの溶解ファージは最近、抗生物質の代替治療として有用であることが証明された。これらのクラスの2番目は、溶解サイクルを介して宿主内で増殖するか、またはそのゲノムが宿主のゲノムが宿主のゲノムに統合される静止状態に入ることができるリソジェニックファージです(図1)。複数の後の世代(4)で誘発される生産。

図1:バクテリオファージによる宿主細胞の感染尾線維と受容体(紫色)との相互作用を介して細菌細胞壁へのファージによる吸着。細胞表面に一度、ファージは収縮鞘(黄色)によって細胞壁に移動されるベースプレート(黒)を使用して細菌細胞に不可逆的に付着する。ファージゲノム(赤色)は、細胞に入り、宿主細胞ゲノムに統合する。

細菌の伝達は自然に起こるプロセスですが、現代の技術を使用して、実験室の設定で細菌に遺伝子を移用するために操作されています。ファージなどのリソジェニックファージのゲノムに目的の遺伝子を挿入することで、これらの遺伝子を細菌のゲノムに移し、その結果、これらの細胞内で発現することができます。形質転換などの他の遺伝子導入方法は、遺伝子の伝達および発現にプラスミドを使用するが、ファージゲノムをレシピエント細菌のそれに挿入することは、この細菌に新しい形質を与える可能性を有するだけでなく、自然に起こる突然変異および細胞環境の他の要因は、転移した遺伝子の機能を変化させる。

結合などの水平遺伝子導入の他の方法と比較して、トランスダクションはドナーおよびレシピエント細胞に必要な基準でかなり柔軟です。使用されているファージのゲノム内に収まる可能性のある任意の遺伝的要素は、ドナー細菌の任意の株から、両方がファージに寛容である限り、ドナー細菌の任意の株から、必要なファージ受容体の発現を必要とする。セル サーフェス。この遺伝子がドナーゲノムから移動し、ファージに包装されると、レシピエントに移すことができる。トランスダクションに続いて、目的の遺伝子を含むレシピエント細菌を選択する必要があります。これは、抗生物質耐性をコードする遺伝子の場合に、目的の遺伝子、または遺伝子の本質的な機能をマークするために、FLAGタグやポリヒスチジンタグなどの遺伝子マーカーを使用することによって行うことができます。さらに、PCRを使用して、トランスダクションの成功をさらに確認することができます。対象遺伝子内の領域にプライマーを使用し、シグナルを陽性対照と比較することにより、目的の遺伝子を有する細菌、および負の対照、ファージのない経度反応と同じステップを受けた細菌。細菌の伝達は分子生物学において有用なツールであるが、特に最近の抗生物質耐性の上昇に関して、細菌の進化において重要な役割を果たし続けている。

この実験では、細菌伝達を用いて、抗生物質アンピシリンに対する耐性をコードする遺伝子を、大腸菌のW3110株からP1バクテリオファージ(5)を介してJ53株に伝達した。この実験は、2つの主要なステップで構成されていました。まず、ドナー株からアンピシリン耐性遺伝子を含むP1ファージの調製。第2に、この遺伝子をP1ファージによるトランスダクションによりレシピエント株に転移させる(図1)。いったん実施すると、アンピシリン耐性遺伝子の正常な転写はqPCRによって決定され得る(図2)。経転移が成功した場合、大腸菌のJ53株はアンピシリンに対して耐性であり、この耐性を与える遺伝子はqPCRによって検出可能である。もし失敗した場合、アンピシリン耐性遺伝子の検出はなく、アンピシリンはJ53株に対する有効な抗生物質として機能し続けるであろう。

図2:qPCRによるトランスダクションの成功の確認トランスダクション反応と陰性対照反応から対象遺伝子に対して検出_されたCq値を比較し、これらの値をハウスキーピング遺伝子に対して正規化することで、細菌の伝達が成功したことを確認することができました。