파지 형질도입: 공여 E.coli에서 수용 E.coli로 암피실린 내성을 전달하는 방법

출처: 알렉산더 S. 골드¹, 토냐 M. 콜핏스^1
1 미생물학학과, 보스턴 대학교 의과대학, 국립 신흥 감염 질병 연구소, 보스턴, MA

트랜스듀션은 박테리아 간의 유전적 교류의 한 형태로, 배니오파지 또는 파지, 독점적으로 대핵 생물을 감염시키는 바이러스의 종류입니다. 이 형태의 DNA 전달은 파지를 통해 박테리아에서 다른 박테리아로, 1951년에 노턴 진더와 조슈아 레더그(Joshua Ledererg)에 의해 발견되었으며, 이들은 이 과정을 "트랜스듀션"(1)이라고 지칭했다. 박테리오파지는 1915년 영국 세균학자 프레드릭 투르트(Frederick Twort)에 의해 처음 발견되었으며, 1917년 프랑스계 캐나다의 미생물학자 펠릭스 데렐(Felix d'Herelle,2)에 의해 독립적으로 발견되었다. 그 이후로, 이러한 파지의 구조와 기능은 널리 특징지어지고 있다 (3), 두 개의 클래스로 이러한 파지를 분할. 이 클래스의 첫 번째는 감염시 숙주 박테리아 내에서 증식하는 lytic 파지, 세균 대사를 방해, 세포를 lysing, 그리고 자손 파지를 해제 (4). 이 항균 활성과 항생제 내성 박테리아의 보급증가의 결과로, 이러한 lytic 파지는 최근 항생제에 대한 대체 치료로 유용함을 입증했다. 이들 클래스의 두 번째는 리액 사이클을 통해 숙주 내에서 증식하거나 게놈이 숙주(그림 1)에 통합되는 정지 상태를 입력할 수 있는 리소겐성 파지이며, 파지 생산능력이 다세대(4)에 유도될 수 있다.

그림 1: 박테리오파지에 의한 숙주 세포의 감염. 꼬리 섬유와 수용체 (보라색) 사이의 상호 작용을 통해 세균 세포 벽에 파지에 의한 흡착. 일단 세포 표면에, 파지는 수축 칼집 (노란색)에 의해 세포벽으로 이동하는 베이스 플레이트 (black)를 사용하여 박테리아 세포에 돌이킬 수 없이 부착된다. 파지 게놈(red)은 세포에 들어가 숙주 세포 게놈에 통합한다.

세균성 트랜스포팅은 자연적으로 발생하는 과정이지만, 현대 기술을 사용하여 실험실 환경에서 유전자를 박테리아로 옮기기 위해 조작되었습니다. 파지와 같은 리존파지의 게놈에 관심 있는 유전자를 삽입함으로써, 이러한 유전자를 박테리아의 게놈으로 옮기고 결과적으로 이러한 세포 내에서 이를 표현할 수 있다. 변형과 같은 유전자 전달의 다른 방법은, 유전자 전달 및 발현을 위해 플라스미드를 사용하지만, 파지 게놈을 받는 박테리아의 것으로 삽입하는 것은 이 박테리아에 새로운 특성을 부여할 뿐만 아니라, 또한 전송된 유전자의 기능을 바꾸기 위하여 세포 환경의 자연적으로 발생하는 돌연변이 및 그밖 요인을 허용합니다.

유도와 같은 수평 유전자 전달의 다른 방법에 비해, 전달은 기증자 및 수령인 세포에 필요한 기준에 상당히 유연하다. 사용되는 파지의 게놈 내부에 들어갈 수 있는 모든 유전 적 원소는 기증자 박테리아의 변형에서 모두 파지에 허용되는 한 받는 사람 박테리아의 변형으로 옮겨질 수 있으며 세포 표면에 필요한 파지 수용체의 발현이 필요합니다. 일단 이 유전자는 기증자 게놈에서 이동하고 파지로 포장되면, 수신자에게 전달될 수 있습니다. 트랜스듀션에 따라 관심 유전자를 포함하는 수신자 박테리아를 선택해야 한다. 이것은 항생 저항을 위해 인코딩하는 유전자의 경우에, 관심의 유전자, 또는 유전자의 본질적인 기능을 표시하기 위하여, FLAG-tag 또는 polyhistidine-tag와 같은 유전 마커의 사용에 의해 행해질 수 있었습니다. 또한 PCR을 사용하여 성공적인 트랜스듀션을 확인할 수 있습니다. 관심 있는 유전자 내의 영역에 프라이머를 사용하고 신호를 긍정적 인 대조군, 관심 유전자가 있는 박테리아 및 음의 대조군, 파지 없이 트랜스유도 반응과 동일한 단계를 겪은 박테리아를 사용한다. 세균성 트랜스포메이션은 분자 생물학에 유용한 도구이지만, 특히 최근 항생제 내성의 부상과 관련하여 박테리아의 진화에 중요한 역할을 하고 있습니다.

본 실험에서, 세균성 트랜스포칭은 P1 박테리오파지(5)를 통해 E.coli의 W3110 균주로부터 항생제 암피실린에 대한 내성을 위한 유전자 인코딩 유전자를 전송하는 데 사용되었다. 이 실험은 두 가지 주요 단계로 구성되었습니다. 첫째, 기증자 균주로부터 암피실린 내성 유전자를 함유하는 P1 파지의 제제. 둘째, P1 파지와의 트랜스듀션에 의한 수신자 균주에 대한 이 유전자의 전달(도 1). 일단 수행되면, 암피실린 저항 유전자의 성공적인 전송은 qPCR에 의해 결정될 수 있었다(도 2). 트랜스포팅이 성공하면 대장균의 J53 균주는 암피실린에 내성이 있으며, qPCR에 의해 검출가능한 이 저항을 부여하는 유전자가 될 것이다. 실패하는 경우에, 암피실린 저항 유전자의 아무 검출도 없을 것이고 ampicillin는 J53 긴장에 대하여 효과적인 항생제로 아직도 작동할 것입니다.

그림 2: qPCR에 의한 성공적인 트랜스듀션확인. 트랜스듀션 반응 및 음성 대조반응으로부터 관심 유전자에 대해 검출된_Cq 값을 비교하고, 가사 유전자에 대하여 이러한 값을 정상화함으로써, 세균성 전이 성공했다는 것을 확인할 수 있었다.