Name: photo-induced cross-linking of unmodified proteins (picup) applied to amyloidogenic peptides
Uploaded: 2009-01-12T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins PICUP Applied to Amyloidogenic Peptides at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים AG027818 ו AG030709 מ-NIH / NIA, 2005/2E מן ל לארי Hillblom קרן, IIRG-07-58334 של איגוד האלצהיימר, 07-65798 מקליפורניה המחלקה לבריאות הציבור.

1. פפטיד הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את ~ 100-200 מיקרוגרם של הפפטיד lyophilized באמצעות microbalance ולהעביר לתוך שכותרתו, סיליקון מצופה, בעלי כושר ספיגה נמוך צינורות microfuge. כאן, אנו משתמשים רצפים האדם של Aβ40, Aβ42, קלציטונין, ואת פוי. </li><li style=";text-align:right;d...

<ol>
	<li>Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+study+of+metastable+amyloidogenic+protein+oligomers+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins.">Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).</li><li>Fancy, D. A., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions:+rapid+and+efficient+cross-linking+triggered+by+long+wavelength+light.">Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).</li><li>Kluger, R., Alagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking+and+protein-protein+interactions&#8212;a+review+with+illustrative+protocols.">Chemical cross-linking and protein-protein interactions&#8212;a review with illustrative protocols.</a> Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).</li><li>Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-linking+chemistry+and+biology:+development+of+multifunctional+photoaffinity+probes.">Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes.</a> Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).</li><li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxic+protein+oligomers&#8212;what+you+see+is+not+always+what+you+get.">Neurotoxic protein oligomers&#8212;what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li><li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+aggregate-free,+low+molecular+weight+amyloid-&#946;+for+assembly+and+toxicity+assays.">Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-&#946; for assembly and toxicity assays.</a> Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).</li><li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;-protein+oligomerization:+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins.">Amyloid &#946;-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li><li>Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;-protein+(A&#946;)+assembly:+A&#946;40+and+A&#946;42+oligomerize+through+distinct+pathways.">Amyloid &#946;-protein (A&#946;) assembly: A&#946;40 and A&#946;42 oligomerize through distinct pathways.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).</li><li>Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+state+characterization+of+amyloid+&#946;-derived+diffusible+ligands.">Solution state characterization of amyloid &#946;-derived diffusible ligands.</a> Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).</li><li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+photochemical+cross-linking&#8212;a+new+tool+for+studies+of+metastable,+amyloidogenic+protein+assemblies).">Rapid photochemical cross-linking&#8212;a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies).</a> Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).</li><li>Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-induced+crosslinking+of+prion+protein+oligomers+and+prions.">Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions.</a> Amyloid. 13, 67-77 (2006).</li><li>Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+events+of+&#945;-synuclein+oligomerization+revealed+by+photo-induced+cross-linking.">The early events of &#945;-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking.</a> Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).</li><li>Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Peptide+oligomerization+state+using+rapid+photochemical+crosslinking.">Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking.</a> Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).</li></ol>

PICUP פותחה במקור כדי ללמוד קומפלקסים חלבונים יציב 2. השיטה יושמה מאוחר ללמוד כמותי של metastable החלבון עמילואיד מכלולים, כולל 10 Aβ, הפריון ומחלות הקשורים PRP Sc 11, ו - α-synuclein 12. הגורמים החשובים ביותר כי יש לקחת בחשבון בעת ​​תכנון הניסוי PICUP הם stoichiometry מגיב, זמן הקרנה...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp</td>
<td>Other</td>
<td>Dolan-Jenner Industries</td>
<td>Model 170-D</td>
<td>The heat generated by the lamp does not affect samples for short incubation periods.</td>
</tr>
<tr>
<td>35-mm SLR camera body</td>
<td>Tool</td>
<td>Pentax</td>
<td>SP500 model</td>
<td>In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source.</td>
</tr>
<tr>
<td>Clear, thin walled PCR tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>951010006 supplied by Fisher L22-003-24</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass vials (1.8 mL)</td>
<td>Other</td>
<td>Kimble Chromatography</td>
<td>60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GRF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Bachem</td>
<td>H-3695</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HFIP</td>
<td>Reagent</td>
<td>TCI America</td>
<td>H0424</td>
<td>Use in a fume hood.</td>
</tr>
<tr>
<td>A&beta;40 and A&beta;42</td>
<td>Reagent</td>
<td>UCLA Biopolymers Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcitonin</td>
<td>Reagent</td>
<td>American Peptide</td>
<td>22-1-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>224758-1G</td>
<td>Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h.</td>
</tr>
<tr>
<td>Ammonium persulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-7460</td>
<td>Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. </td>
</tr>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M7154-25 ML</td>
<td>Can be used when SDS-PAGE analysis is performed.</td>
</tr>
<tr>
<td>Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC1676</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
<td>Tool</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EI0001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tricine Gels (10-20%)</td>
<td>Other</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EC6625B0X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tricine SDS Running Buffer (10x )</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC1675</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silver Express Staining Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC6100</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

photo-induced cross-linking of unmodified proteins (picup) applied to amyloidogenic peptides

הרכבה של חלבונים amyloidogenic לתוך oligomers רעילים הינה אירוע מכונן בפתוגנזה של מחלות misfolding חלבון, כולל אלצהיימר, פרקינסון, ומחלות של הנטינגטון, תורשתיות טרשת לרוחב amyotrophic, וסוכרת מסוג 2. בשל אופי metastable של מכלולים אלה חלבון, קשה להעריך את גודל oligomer שלהם הפצה כמותית תוך שימוש בשיטות קלאסיות, כגון אלקטרופורזה, כרומטוגרפיה, הקרינה, או פיזור אור דינאמי. Oligomers של חלבונים amyloidogenic קיימים תערובות metastable, שבו oligomers לנתק לתוך מונומרים ולשייך לתוך מכלולים גדולים בו זמנית. PICUP מייצב אוכלוסיות oligomer על ידי cross-linking וכאשר בשילוב עם שיטות חלוקה, כגון אלקטרופורזה dodecyl נתרן סולפט ג&#39;ל polyacrylamide (SDS-PAGE) או גודל הרחקת כרומטוגרפיה (SEC), PICUP מספק תמונות קוולנטיים של הפצות גודל oligomer שהיה קיים לפני צלב -linking. לפיכך, PICUP מאפשרת הדמיה ניתוח כמותי של אוכלוסיות חלבון metastable וניתן להשתמש בו כדי לפקח על הרכבה לפענח את יחסי הגומלין בין השינויים ברצף oligomerization<sup&gt; 1</sup&gt;. באופן מכני, PICUP כרוך צילום חמצון של רו<sup&gt; 2 +</sup&gt; בתוך קומפלקס (bipyridyl) טריס (II) Ru (RuBpy) כדי Ru<sup&gt; 3 +</sup&gt; על ידי הקרנה עם האור הנראה בנוכחות acceptor אלקטרון. רו<sup&gt; 3 +</sup&gt; הוא מחמצן חזק אחד אלקטרונים מסוגלים הפשטה אלקטרון מולקולת חלבון שכנות, יצירת חלבון קיצוני<sup&gt; 1,2</sup&gt;. הרדיקלים אינם יציבים, מאוד-reactive המינים ולכן נעלמים במהירות באמצעות מגוון רחב של תגובות הפנים ו מולקולאריים. רדיקלי יכול לנצל את האנרגיה הגבוהה של אלקטרון מזווג להגיב עם מונומר נוסף חלבון להרכיב dimeric הרדיקלי, אשר לאחר מכן מאבד אטום מימן צורות יציבה, קוולנטית צמודות דימר. Dimer עשויה להגיב אז עוד יותר באמצעות מנגנון דומה עם מונומרים או הדימרים השני כדי ליצור מסדר גבוה oligomers. יתרונות יחסיים PICUP אחרים צילום או כימי cross-linking שיטות<sup&gt; 3,4</sup&gt; כוללים חשיפה קצר (≤ 1 ים) אור שאינו הרסני גלוי, אין צורך<i&gt; מראש פקטו</i&gt; שינוי של רצף מקומיים, באורך אפס קוולנטיים cross-linking. בנוסף, מאפשר PICUP cross-linking של חלבונים בתוך ה-pH רחב טווחי טמפרטורה, כולל פרמטרים פיזיולוגיים. הנה, אנחנו מדגימים יישום PICUP אל cross-linking של שלושה חלבונים amyloidogenic 40 - ו 42-β-שאריות החלבון עמילואיד וריאנטים (Aβ40 ו Aβ42), ו קלציטונין, לבין חלבון שליטה, הורמון גדילה גורם משחרר (פוי).

Watch this Scientific Journal Video about Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins PICUP Applied to Amyloidogenic Peptides at JoVE.com

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins PICUP Applied to Amyloidogenic Peptides

תמונה-Induced cross-linking של חלבונים ללא שינוי (PICUP) מאפשר אפיון של התפלגות גודל oligomer תערובות חלבון metastable. אנו מדגימים יישום PICUP שלושה פפטידים נציג amyloidogenic 40 - ו 42-שאריות צורות של עמילואיד β-חלבון, קלציטונין ו פפטיד לשלוט הורמון גדילה גורם משחרר.

תמונה-induced cross-linking של חלבונים ללא שינוי (PICUP) יישומית כדי פפטידים Amyloidogenic

The assembly of amyloidogenic proteins into toxic oligomers is a seminal event in the pathogenesis of protein misfolding diseases, including Alzheimer's, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

Electrophoretic Separation of Proteins

ההפרדה Electrophoretic של חלבונים

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Staining Proteins in Gels

מכתים חלבונים ג&#39;ל

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

שיטה לקטינים HPLC להעשיר פפטידים סלקטיבי-glycosylated מ דגימות ביולוגיות מורכבות

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Microdissection לייזר יישומית כדי Gene Expression Profiling של תת קבוצה של תאים מן תסיסנית אגף דיסק

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

לקבוע את התרומה של מערכות אנרגיה במהלך פעילות גופנית

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

הקרנת תפוקה גבוהה ביטוי כמותי וטיהור יישומים לחלבוני ארס רקומביננטי דיסולפיד עשירים הופק ב<em&gt; א coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

טיהור ללא chromatographic של פוליפפטידים דמויי אלסטין רקומביננטי וFusions עם פפטידים וחלבונים מן<em&gt; חיידקי Escherichia</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA)

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment Kartchner Caverns, AZ, USA

השימוש בMALDI-TOF המוני ספקטרומטריית ומסד נתונים מותאמים אישית לאפיון חיידקים ילידים למערת סביבה ייחודית (Kartchner מערות, AZ, ארה&quot;ב)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

שיטה לבחירת Aptamers מיתוג מבנה יישומית לColorimetric זהב Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...