Name: photo-induced cross-linking of unmodified proteins (picup) applied to amyloidogenic peptides
Uploaded: 2009-01-12T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins PICUP Applied to Amyloidogenic Peptides at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами AG027818 и AG030709 из NIH / НИА, 2005/2E от Ларри Л. Hillblom Фонда IIRG-07-58334 от болезни Альцгеймера Ассоциации, а 07-65798 от Калифорнийского департамента здравоохранения.

1. Пептид подготовки <ol><li> Отвешивать ~ 100-200 мкг лиофилизированного пептида использованием микровесов и передачи в подписанные, кремния, покрытые оболочкой, низким адсорбента труб отцентрифугировать. Здесь мы используем человеческие последовательности Aβ40, Aβ42, кальцитонин, и GRF. </li><li> ?...

<ol>
	<li>Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+study+of+metastable+amyloidogenic+protein+oligomers+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins.">Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).</li><li>Fancy, D. A., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions:+rapid+and+efficient+cross-linking+triggered+by+long+wavelength+light.">Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).</li><li>Kluger, R., Alagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking+and+protein-protein+interactions&#8212;a+review+with+illustrative+protocols.">Chemical cross-linking and protein-protein interactions&#8212;a review with illustrative protocols.</a> Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).</li><li>Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-linking+chemistry+and+biology:+development+of+multifunctional+photoaffinity+probes.">Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes.</a> Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).</li><li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxic+protein+oligomers&#8212;what+you+see+is+not+always+what+you+get.">Neurotoxic protein oligomers&#8212;what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li><li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+aggregate-free,+low+molecular+weight+amyloid-&#946;+for+assembly+and+toxicity+assays.">Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-&#946; for assembly and toxicity assays.</a> Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).</li><li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;-protein+oligomerization:+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins.">Amyloid &#946;-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li><li>Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;-protein+(A&#946;)+assembly:+A&#946;40+and+A&#946;42+oligomerize+through+distinct+pathways.">Amyloid &#946;-protein (A&#946;) assembly: A&#946;40 and A&#946;42 oligomerize through distinct pathways.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).</li><li>Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+state+characterization+of+amyloid+&#946;-derived+diffusible+ligands.">Solution state characterization of amyloid &#946;-derived diffusible ligands.</a> Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).</li><li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+photochemical+cross-linking&#8212;a+new+tool+for+studies+of+metastable,+amyloidogenic+protein+assemblies).">Rapid photochemical cross-linking&#8212;a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies).</a> Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).</li><li>Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-induced+crosslinking+of+prion+protein+oligomers+and+prions.">Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions.</a> Amyloid. 13, 67-77 (2006).</li><li>Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+events+of+&#945;-synuclein+oligomerization+revealed+by+photo-induced+cross-linking.">The early events of &#945;-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking.</a> Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).</li><li>Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Peptide+oligomerization+state+using+rapid+photochemical+crosslinking.">Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking.</a> Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).</li></ol>

PICUP была разработана первоначально для изучения устойчивые комплексы белка 2. Метод был применен позже количественное исследование метастабильных амилоидных белков собраний, в том числе Ар 10, прионных болезней и связанных PrP Sc 11 и α-синуклеина 12. Наиболее важными факторами,...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp</td>
<td>Other</td>
<td>Dolan-Jenner Industries</td>
<td>Model 170-D</td>
<td>The heat generated by the lamp does not affect samples for short incubation periods.</td>
</tr>
<tr>
<td>35-mm SLR camera body</td>
<td>Tool</td>
<td>Pentax</td>
<td>SP500 model</td>
<td>In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source.</td>
</tr>
<tr>
<td>Clear, thin walled PCR tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>951010006 supplied by Fisher L22-003-24</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass vials (1.8 mL)</td>
<td>Other</td>
<td>Kimble Chromatography</td>
<td>60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GRF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Bachem</td>
<td>H-3695</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HFIP</td>
<td>Reagent</td>
<td>TCI America</td>
<td>H0424</td>
<td>Use in a fume hood.</td>
</tr>
<tr>
<td>A&beta;40 and A&beta;42</td>
<td>Reagent</td>
<td>UCLA Biopolymers Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcitonin</td>
<td>Reagent</td>
<td>American Peptide</td>
<td>22-1-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>224758-1G</td>
<td>Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h.</td>
</tr>
<tr>
<td>Ammonium persulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-7460</td>
<td>Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. </td>
</tr>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M7154-25 ML</td>
<td>Can be used when SDS-PAGE analysis is performed.</td>
</tr>
<tr>
<td>Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC1676</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
<td>Tool</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EI0001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tricine Gels (10-20%)</td>
<td>Other</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EC6625B0X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tricine SDS Running Buffer (10x )</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC1675</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silver Express Staining Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC6100</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

photo-induced cross-linking of unmodified proteins (picup) applied to amyloidogenic peptides

Сборка амилоидогенный белков в токсических олигомеров является знаковым событием в патогенезе неправильного фолдинга белков заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, Паркинсона, болезни Гентингтона, наследственный боковой амиотрофический склероз и сахарный диабет 2 типа. Благодаря метастабильных природу этих белков сборки, трудно оценить их распределение по размерам олигомер количественно с использованием классических методов, таких как электрофорез, хроматография, флуоресценция, или динамического рассеяния света. Олигомеров амилоидогенный белки существуют в виде метастабильных смесей, в которых олигомеров распадаются на мономеры и объединяться в большие сборки одновременно. PICUP стабилизирует олигомер населения путем ковалентного сшивания и в сочетании с фракционирования методы, такие как додецилсульфата натрия полиакриламидном геле (SDS-PAGE) или гель-хроматографии (SEC), PICUP предоставляет снимки распределения олигомеров размера, который существовал до креста сшивания. Таким образом, PICUP позволяет визуализации и количественного анализа метастабильных популяции белок и может быть использован для контроля сборки и расшифровать отношения между последовательностью изменений и олигомеризации<sup&gt; 1</sup&gt;. Механистически, PICUP включает в себя фото-окисления Ru<sup&gt; 2 +</sup&gt; В трис (бипиридил) Ru (II) комплекс (RuBpy) для Ru<sup&gt; 3 +</sup&gt; При облучении видимым светом в присутствии акцептора электрона. Ru<sup&gt; 3 +</sup&gt; Является сильным одноэлектронного окислителя способна абстрагирование электрон из соседней молекулы белка, производя белок радикальных<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Радикалы нестабильны, высоко-активных форм и, следовательно, быстро исчезают с помощью различных внутри-и межмолекулярных реакций. Радикал может использовать высокую энергию непарный электрон взаимодействует с другим белком мономера формированию димерных радикал, который впоследствии теряет атом водорода и образует стабильный, ковалентно-связанных димеров. Димера может затем реагировать далее через подобный механизм с мономерами или других димеров для формирования более высокого порядка олигомеров. Преимущества относительной PICUP другим фото-или химического сшивания методы<sup&gt; 3,4</sup&gt; Включает короткие (≤ 1 с) воздействия неразрушающего видимый свет, нет необходимости<i&gt; Предварительно факто</i&gt; Модификация родной последовательности, а нулевой длины ковалентной сшивки. Кроме того, PICUP позволяет сшивки белков в широком рН и температур, в том числе физиологические параметры. Здесь мы демонстрируем применение PICUP для сшивания трех амилоидогенный белков 40 - и 42-остаток амилоидных β-белковые варианты (Aβ40 и Aβ42), а также кальцитонин, и контроль белка, рост гормона рилизинг-фактора (ГРФ).

Watch this Scientific Journal Video about Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins PICUP Applied to Amyloidogenic Peptides at JoVE.com

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins PICUP Applied to Amyloidogenic Peptides

Фотоиндуцированные сшивания немодифицированных белков (PICUP) позволяет характеристика олигомер распределение по размерам в метастабильных смесей белков. Мы демонстрируем применение PICUP-три представителя амилоидогенный пептиды, 40 - и 42-остаток форм амилоидных β-белок, и кальцитонин, а также контроль пептидных гормонов роста-рилизинг-фактора.

Фото-индуцированные сшивание Немодифицированные Белки (PICUP) Применительно к амилоидогенный пептиды

The assembly of amyloidogenic proteins into toxic oligomers is a seminal event in the pathogenesis of protein misfolding diseases, including Alzheimer's, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

Electrophoretic Separation of Proteins

Электрофоретического разделения белков

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Staining Proteins in Gels

Окрашивание белков в гелях

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Лектина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии обогатить Выборочно-гликозилированного пептидов из сложных биологических образцов

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Выделение лабильной Multi-белковые комплексы по В естественных условиях Контролируемые Сотовая сшивания и иммуно-магнитного аффинной хроматографии

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Лазерная микродиссекция Применительно к экспрессии генов Профилирование подмножество ячеек из Drosophila Крыло диска

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Определение вклада Energy Systems во время тренировки

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Высокая пропускная количественном выражении Скрининг и очистка Применительно к рекомбинантный дисульфид-богатые Venom белков, продуцируемых в<em&gt; Е. палочка</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Номера хроматографической очистки рекомбинантного Эластин-подобных полипептидов и их слияний с пептидов и белков с<em&gt; Кишечная палочка</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA)

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment Kartchner Caverns, AZ, USA

Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии и пользовательскую базу данных для характеристики бактерий из числа коренных народов уникального пещерного окружающей среды (Kartchner Пещеры, AZ, США)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Способ выбора Структура переключения Аптамеры Применительно к колориметрическим наночастиц золота Пробирной

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...