Name: purification and visualization of influenza a viral ribonucleoprotein complexes
Uploaded: 2009-02-09T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes at JoVE.com

<p class="jove_content"> Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Canada Foundation for Innovation (CFI), die Canadian Institute of Health Research (CIHR) und dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) unterstützt. </p>

<p class="jove_title"> Teil 1: Störung des Influenza-A-Virion </p><ol><li> Add 750 ul der MNT-Puffer (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) in einem Beckman Polycarbonat-Zentrifugenröhrchen (11 mm x 34 mm) entwickelt, um in eine TLA-120,2 Rotor für den Einsatz in einem Beckman Optima fit Max-E Ultrazentrifuge. </li><li> Add 500 ul des Influenza A Virus (H3N2 X-31 A/AICHI/68 Stamm; 2 mg / ml) in die Röhre. Mix das Virus mit der MNT-Puffer durch Auf-und Abpipettieren mehrmals. </li><li> Zentrifuge für 10 Minuten bei 109.000 xg, 4 ° C ...

<ol>
	<li>Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+import+of+microinjected+influenza+virus+ribonucleoproteins.">Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins.</a> <em style='font-style: italic'>Virology</em>. <b>202</b>, 1028-1033 (1994).</li><li>Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+the+nuclear+localization+sequences+on+influenza+a+ribonucleoprotein+complexes.">Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes.</a> <em style='font-style: italic'>J Mol Biol</em>. <b>374</b>, 910-916 (2007).</li><li>Gasteiger, E., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>The Proteomics Protocols Handbook</em>. , 571-607 (2005).</li><li>Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Pant&#233;, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+import+of+influenza+A+viral+ribonucleoprotein+complexes+is+mediated+by+two+nuclear+localization+sequences+on+viral+nucleoprotein.">Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein.</a> <em style='font-style: italic'>Virol J</em>. <b>4</b>, 49-49 (2007).</li><li>Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single-particle+tracking+to+study+nuclear+trafficking+of+viral+genes.">Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes.</a> <em style='font-style: italic'>Biophys J</em>. <b>87</b>, 2749-2758 (2004).</li></ol>

<p class="jove_content"> Die Reinigung von vRNPs wird über das Verfahren durch Kemler <em>et al.</em> (1994) beschrieben wird. <sup>1</sup> Wir und andere haben auch dieses Protokoll verwendet, um vRNPs zu isolieren, um ihre nuklearen Import-Studie. <sup>2,4,5</sup> </p><p class="jove_content"> Wir empfehlen die Verwendung von RNase-freien Spitzen und Rohre beim Manipulieren vRNPs weil das virale Genom von RNA besteht, und damit verschlechtert sich leicht in die Gegenwart von RNA. Darüber hinaus sollten alle Puffer in Wasser, RNase frei gemac...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Charles River Laboratories</td>
<td>490715</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M-8250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>G33-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octylglucoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O-8001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lysolecithin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L-4129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiothreitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D-9779</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coomassie brilliant blue G-250</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kodak</td>
<td>1367796</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>750024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Uranyl Acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>19481</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Molybdate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A-674</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Optima MAX-E Ultracentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>434491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>367280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eppendorf Thermomixer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Brinkman</td>
<td>022670000</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

purification and visualization of influenza a viral ribonucleoprotein complexes

<p class="jove_content">Das Influenza-A-Virus-Genom besteht aus acht negativen Sinne, einsträngige RNA-Moleküle, die individuell mit mehreren Kopien des Influenza-A-Nukleoprotein (NP) in virale ribonulceoprotein Partikel (vRNPs) verpackt. Die Influenza vRNPs sind innerhalb der Virushülle umgeben. Während Eindringen in die Zelle, jedoch sind diese vRNP Komplexe in das Zytoplasma freigesetzt, wo sie Zugriff auf den Host Kerntransport Maschinen zu gewinnen. Um die nukleare Import von Influenza vRNPs und die Replikation des Influenza-Genom-Studie, ist es sinnvoll, mit isolierten vRNPs Arbeit, so dass andere Komponenten des Virus nicht mit diesen Prozessen stören. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um diese vRNPs von der Influenza A-Virus zu reinigen. Das Verfahren beginnt mit der Unterbrechung der Influenza-A-Virion mit Reinigungsmitteln, um die vRNP Komplexe aus den umhüllten Virion freizugeben. Die vRNPs werden dann von den anderen Komponenten des Influenza-A-Virion auf einem 33-70% diskontinuierliche Glycerin-Gradienten durch Geschwindigkeit Sedimentation abgeschieden. Die Fraktionen aus der Glycerin-Gradienten gewonnen werden dann über SDS-PAGE nach Färbung mit Coomassie-Blau analysiert. Die Peak-Fraktionen, die NP werden dann gepoolt und konzentriert durch Zentrifugation. Nach Einengen wird die Integrität der vRNPs durch Visualisierung der vRNPs durch Transmissionselektronenmikroskopie nach negativen Färbung überprüft. Das Glycerin Gradientenreinigung ist eine Abwandlung davon aus Kemler<em&gt; Et al.</em&gt; (1994)<sup&gt; 1</sup&gt;, Und die negative Färbung wurde von Wu durchgeführt<em&gt; Et al.</em&gt; (2007).<sup&gt; 2</sup</p>

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Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

<p class="jove_content">Das Genom der Influenza A-Virus besteht aus acht separaten Komplexen von RNA und Proteinen, genannt virale Ribonukleoproteinkomplexe (vRNPs). Dieses Papier beschreibt die Glycerin Gradientenreinigung und Transmissionselektronenmikroskopie Visualisierung von Influenza-A-vRNPs.</p>

Reinigung und Visualisierung von Influenza A Virus Ribonukleoproteinkomplexe

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Herstellung, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanoidkomplexe für die Verwendung als Kontrastmittel für die Magnetresonanz-Tomographie

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Reinigung von Hsp104, ein Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Chromatographische Reinigung von hoch aktiven Hefe Ribosomen

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Identification of Protein Complexes in <em>Escherichia coli</em> using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

AFM-basierte Mapping der elastischen Eigenschaften der Zellwände: auf der Tissue-, Handy-und subzellulärer Beschlüsse

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3

Ein-Schritt-Reinigung von Twin-Strep-markierten Proteine ​​und ihre Komplexe auf Mit Bis (Sulfosuccinimidyl) Strep-Tactin Resin Vernetzte suberat (BS3)

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Generation und Reinigung von Menschen INO80 Chromatin Remodeling Komplexe und Subkomplexe

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...