Name: purification and visualization of influenza a viral ribonucleoprotein complexes
Uploaded: 2009-02-09T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes at JoVE.com

<p class="jove_content"> Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti della Fondazione canadese per l&#39;innovazione (CFI), il Canadian Institute of Health Research (CIHR), e le scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC). </p>

<p class="jove_title"> Parte 1: L&#39;interruzione della Influenza A Virion </p><ol><li> Aggiungere 750 ml di tampone MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) in una centrifuga Beckman tubo di policarbonato (11 mm x 34 mm) progettato per adattarsi in un TLA-120,2 rotore per l&#39;uso in Optima Beckman Max-E ultracentrifuga. </li><li> Aggiungere 500 ml di virus influenzale A (H3N2 X-31 A/AICHI/68 ceppo; 2 mg / ml) in quel tubo. Mescolare il virus con il tampone MNT pipettando su e giù parecchie volte. </li><li> Centrifugare per 10 minut...

<ol>
	<li>Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+import+of+microinjected+influenza+virus+ribonucleoproteins.">Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins.</a> <em style='font-style: italic'>Virology</em>. <b>202</b>, 1028-1033 (1994).</li><li>Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+the+nuclear+localization+sequences+on+influenza+a+ribonucleoprotein+complexes.">Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes.</a> <em style='font-style: italic'>J Mol Biol</em>. <b>374</b>, 910-916 (2007).</li><li>Gasteiger, E., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>The Proteomics Protocols Handbook</em>. , 571-607 (2005).</li><li>Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Pant&#233;, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+import+of+influenza+A+viral+ribonucleoprotein+complexes+is+mediated+by+two+nuclear+localization+sequences+on+viral+nucleoprotein.">Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein.</a> <em style='font-style: italic'>Virol J</em>. <b>4</b>, 49-49 (2007).</li><li>Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single-particle+tracking+to+study+nuclear+trafficking+of+viral+genes.">Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes.</a> <em style='font-style: italic'>Biophys J</em>. <b>87</b>, 2749-2758 (2004).</li></ol>

<p class="jove_content"> La purificazione di vRNPs si basa sulla procedura descritta da Kemler <em>et al.</em> (1994) <sup>1.</sup> Noi e gli altri hanno usato anche questo protocollo per isolare vRNPs di studiare la loro importazione nucleare. <sup>2,4,5</sup> </p><p class="jove_content"> Si consiglia l&#39;uso di RNasi-free suggerimenti e tubi durante la manipolazione vRNPs perché il genoma virale è costituito da RNA, e quindi facilmente degrada in presenza di RNA. Inoltre, tutti i buffer dovrebbe essere effettuato in acqua che è RNasi lib...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Charles River Laboratories</td>
<td>490715</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M-8250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>G33-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octylglucoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O-8001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lysolecithin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L-4129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiothreitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D-9779</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coomassie brilliant blue G-250</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kodak</td>
<td>1367796</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>750024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Uranyl Acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>19481</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Molybdate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A-674</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Optima MAX-E Ultracentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>434491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>367280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eppendorf Thermomixer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Brinkman</td>
<td>022670000</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

purification and visualization of influenza a viral ribonucleoprotein complexes

<p class="jove_content">L&#39;influenza A genoma virale è costituito da otto-senso negativo, singole molecole di RNA, confezionati singolarmente con più copie del influenza A nucleoproteina (NP) in particelle ribonulceoprotein virale (vRNPs). Il vRNPs dell&#39;influenza sono racchiusi all&#39;interno della busta virale. Durante l&#39;immissione delle cellule, tuttavia, questi complessi vRNP vengono rilasciati nel citoplasma, dove l&#39;accesso al macchinario di trasporto nucleare host. Per studiare l&#39;importazione nucleare di vRNPs influenza e la replicazione del genoma dell&#39;influenza, è utile per lavorare con vRNPs isolato in modo che gli altri componenti del virus non interferiscono con questi processi. Qui, descriviamo una procedura per purificare queste vRNPs dal virus. La procedura inizia con la rottura del virione influenza A con detergenti al fine di rilasciare i complessi vRNP dal virione avvolto. Il vRNPs vengono separati dagli altri componenti del virione influenza A su una pendenza 33-70% glicerolo discontinuo per sedimentazione velocità. Le frazioni ottenuto dal gradiente di glicerolo vengono poi analizzati attraverso SDS-PAGE dopo colorazione con Coomassie blu. Le frazioni di punta contenenti NP sono poi sommati insieme e concentrato per centrifugazione. Dopo la concentrazione, l&#39;integrità del vRNPs è verificata da visualizzazione del vRNPs tramite microscopia elettronica a trasmissione dopo colorazione negativa. La purificazione gradiente di glicerolo è una modifica di quella di Kemler<em&gt; Et al.</em&gt; (1994)<sup&gt; 1</sup&gt;, E la colorazione negativa è stata eseguita da Wu<em&gt; Et al.</em&gt; (2007).<sup&gt; 2</sup</p>

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Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

<p class="jove_content">Il genoma del virus influenzale A si compone di otto complessi separati di RNA e proteine, chiamate complessi ribonucleoproteina virale (vRNPs). Questo documento descrive la purificazione gradiente glicerolo e microscopia elettronica visualizzazione trasmissione di influenza A vRNPs.</p>

Purificazione e visualizzazione di influenza A Complessi Ribonucleoproteina virale

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

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