Name: purification and visualization of influenza a viral ribonucleoprotein complexes
Uploaded: 2009-02-09T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes at JoVE.com

<p class="jove_content"> Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Canadense para a Inovação (CFI), o Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR), e as Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia Council of Canada (NSERC). </p>

<p class="jove_title"> Parte 1: Rompimento da Influenza A Virion </p><ol><li> Adicionar 750 mL de tampão MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) em um tubo de centrífuga Beckman policarbonato (11 mm x 34 mm) projetado para caber em um rotor TLA-120,2 para uso em um Optima Beckman Max-E ultracentrífuga. </li><li> Adicionar 500 mL do vírus influenza A (H3N2 X-31 A/AICHI/68 tensão; 2 mg / ml) em que o tubo. Misture o vírus com o buffer MNT pipetando cima e para baixo várias vezes. </li><li> Centrifugar por 10 minutos a 109.000 xg, ...

<ol>
	<li>Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+import+of+microinjected+influenza+virus+ribonucleoproteins.">Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins.</a> <em style='font-style: italic'>Virology</em>. <b>202</b>, 1028-1033 (1994).</li><li>Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+the+nuclear+localization+sequences+on+influenza+a+ribonucleoprotein+complexes.">Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes.</a> <em style='font-style: italic'>J Mol Biol</em>. <b>374</b>, 910-916 (2007).</li><li>Gasteiger, E., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>The Proteomics Protocols Handbook</em>. , 571-607 (2005).</li><li>Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Pant&#233;, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+import+of+influenza+A+viral+ribonucleoprotein+complexes+is+mediated+by+two+nuclear+localization+sequences+on+viral+nucleoprotein.">Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein.</a> <em style='font-style: italic'>Virol J</em>. <b>4</b>, 49-49 (2007).</li><li>Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single-particle+tracking+to+study+nuclear+trafficking+of+viral+genes.">Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes.</a> <em style='font-style: italic'>Biophys J</em>. <b>87</b>, 2749-2758 (2004).</li></ol>

<p class="jove_content"> A purificação da vRNPs é baseado no procedimento descrito por Kemler <em>et al.</em> (1994). <sup>1</sup> Nós e os outros também têm usado este protocolo para isolar vRNPs para estudar sua importação nuclear. <sup>2,4,5</sup> </p><p class="jove_content"> Recomendamos o uso de RNase dicas e tubos ao manipular vRNPs porque o genoma viral é composto de RNA, e, portanto, degrada facilmente na presença de RNA. Além disso, todos os buffers deve ser feita em água que é RNase livre. O protocolo aqui descrito foi re...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Charles River Laboratories</td>
<td>490715</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M-8250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>G33-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octylglucoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O-8001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lysolecithin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L-4129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiothreitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D-9779</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coomassie brilliant blue G-250</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kodak</td>
<td>1367796</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>750024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Uranyl Acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>19481</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Molybdate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A-674</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Optima MAX-E Ultracentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>434491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>367280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eppendorf Thermomixer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Brinkman</td>
<td>022670000</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

purification and visualization of influenza a viral ribonucleoprotein complexes

<p class="jove_content">A influenza A genoma viral é composto por oito sentido negativo, as moléculas de RNA de fita única, embalados individualmente com várias cópias da influenza A nucleoproteína (NP) em partículas ribonulceoprotein viral (vRNPs). O vRNPs influenza são colocados dentro do envelope viral. Durante a entrada de celulares, no entanto, esses complexos vRNP são liberados para o citoplasma, onde eles ter acesso ao equipamento de transportes anfitrião nuclear. A fim de estudar a importação nuclear de vRNPs influenza ea replicação do genoma da gripe, é útil para trabalhar com vRNPs isolada de modo que outros componentes do vírus não interferem com estes processos. Aqui, descrevemos um procedimento para purificar essas vRNPs do vírus influenza A. O procedimento começa com o rompimento da influenza A virion com detergentes, a fim de liberar os complexos vRNP do virion envolvido. O vRNPs são então separados dos outros componentes da influenza A virion em um gradiente de glicerol 33-70% descontínua por sedimentação velocidade. As frações obtidas a partir do gradiente de glicerol são analisados ​​na via SDS-PAGE após coloração com Coomassie blue. As frações de pico contendo NP são então reunidos e concentrados por centrifugação. Após a concentração, a integridade do vRNPs é verificada através da visualização do vRNPs por microscopia eletrônica de transmissão após coloração negativa. A purificação do gradiente de glicerol é uma modificação do que a partir de Kemler<em&gt; Et al.</em&gt; (1994)<sup&gt; 1</sup&gt;, Ea coloração negativa foi realizado por Wu<em&gt; Et al.</em&gt; (2007).<sup&gt; 2</sup</p>

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Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

<p class="jove_content">O genoma do vírus influenza A é composto por oito complexos separada de RNA e proteínas, denominadas complexos de ribonucleoproteínas viral (vRNPs). Este artigo descreve a purificação gradiente glicerol e transmissão de visualização microscopia eletrônica de influenza A vRNPs.</p>

Purificação e Visualização de Influenza A complexos de ribonucleoproteínas Viral

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Purificação de preparação, e Caracterização de Complexos de lantanídeos para uso como agentes de contraste para Imagem por Ressonância Magnética

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Purificação da Hsp104, um Disaggregase Protein

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

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Purificação cromatográfica de Ribossomos Yeast Highly Active

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Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Método para o isolamento e identificação de mRNAs, microRNAs e componentes proteicos de complexos de ribonucleoproteínas de extratos celulares utilizando RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Identification of Protein Complexes in <em>Escherichia coli</em> using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

Mapeamento baseado em AFM das propriedades elásticas de paredes celulares: em tecido, os celulares, e as Resoluções Subcelulares

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3

Um passo de Purificação de Proteínas Twin-Strep-tag e seus complexos de Strep-Tactin Resina reticulado com Bis (sulfossuccinimidilo) suberato (BS3)

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Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial

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Geração e Purificação de Complexos e Subcomplexos de Remodelação de Cromatina INO80 Humana

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