Name: purification and visualization of influenza a viral ribonucleoprotein complexes
Uploaded: 2009-02-09T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes at JoVE.com

<p class="jove_content"> Detta arbete har finansierats med bidrag från Kanada Foundation for Innovation (CFI), den kanadensiska Institute of Health Research (CIHR) och naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC). </p>

<p class="jove_title"> Del 1: Rubbning av influensa A Virion </p><ol><li> Tillsätt 750 ìl MNT buffert (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) till en Beckman polykarbonat centrifugrör (11 mm x 34 mm) utformad för att passa in i en TLA-120,2 rotor för användning i en Beckman Optima Max-E ultracentrifugen. </li><li> Tillsätt 500 ìl av influensa A-virus (H3N2 X-31 A/AICHI/68 stam, 2 mg / ml) in i det röret. Blanda viruset med MNT buffert genom att pipettera upp och ned flera gånger. </li><li> Centrifugera i 10 minuter vid 109.000 xg...

<ol>
	<li>Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+import+of+microinjected+influenza+virus+ribonucleoproteins.">Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins.</a> <em style='font-style: italic'>Virology</em>. <b>202</b>, 1028-1033 (1994).</li><li>Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+the+nuclear+localization+sequences+on+influenza+a+ribonucleoprotein+complexes.">Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes.</a> <em style='font-style: italic'>J Mol Biol</em>. <b>374</b>, 910-916 (2007).</li><li>Gasteiger, E., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>The Proteomics Protocols Handbook</em>. , 571-607 (2005).</li><li>Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Pant&#233;, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+import+of+influenza+A+viral+ribonucleoprotein+complexes+is+mediated+by+two+nuclear+localization+sequences+on+viral+nucleoprotein.">Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein.</a> <em style='font-style: italic'>Virol J</em>. <b>4</b>, 49-49 (2007).</li><li>Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single-particle+tracking+to+study+nuclear+trafficking+of+viral+genes.">Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes.</a> <em style='font-style: italic'>Biophys J</em>. <b>87</b>, 2749-2758 (2004).</li></ol>

<p class="jove_content"> Rening av vRNPs bygger på den som beskrivs Kemler <em>et al.</em> (1994). <sup>1</sup> Vi och andra har också använt detta protokoll för att isolera vRNPs att studera deras nukleära import. <sup>2,4,5</sup> </p><p class="jove_content"> Vi rekommenderar användning av RNase-fria tips och tuber när manipulera vRNPs eftersom det virala genomet består av RNA, och därför bryter lätt i närvaro av RNA. Dessutom bör alla buffertar ske i vatten som är RNas gratis. Protokollet som beskrivs här genomfördes med en su...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Charles River Laboratories</td>
<td>490715</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M-8250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>G33-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octylglucoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O-8001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lysolecithin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L-4129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiothreitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D-9779</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coomassie brilliant blue G-250</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kodak</td>
<td>1367796</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>750024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Uranyl Acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>19481</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Molybdate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A-674</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Optima MAX-E Ultracentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>434491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>367280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eppendorf Thermomixer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Brinkman</td>
<td>022670000</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

purification and visualization of influenza a viral ribonucleoprotein complexes

<p class="jove_content">Influensa A virala genomet består av åtta negativ bemärkelse, enda RNA-molekyler, individuellt packad med flera kopior av influensa A nukleoprotein (NP) i virus ribonulceoprotein partiklar (vRNPs). Den influensa vRNPs är innesluten i den virala kuvertet. Under cellinmatning, dock dessa vRNP komplex släppas ut i cytoplasman, där de får tillgång till värden kärntransport maskiner. För att studera det nukleära import av influensa vRNPs och replikation av influensavirus genomet, är det bra att arbeta med isolerade vRNPs så att andra delar av viruset inte stör dessa processer. Här beskriver vi en procedur för att rena dessa vRNPs från influensa A-virus. Förfarandet inleds med störningar av influensa A-virus med tvättmedel för att lossa vRNP komplex från insvept virionens. Den vRNPs separeras sedan från andra delar av influensa A virus på en 33-70% diskontinuerlig glycerol lutning av hastighet sedimentering. De procenttal som erhålls från glycerol gradienten analyseras sedan på via SDS-PAGE efter färgning med Coomassie blå. Den högsta fraktioner som innehåller nonylfenol sedan sammanförs och koncentreras genom centrifugering. Efter koncentrationen är integritet vRNPs kontrolleras av visualisering av vRNPs genom transmissionselektronmikroskop efter negativa färgning. Den glycerol lutning reningen är en modifiering av det från Kemler<em&gt; Et al.</em&gt; (1994)<sup&gt; 1</sup&gt;, Och negativ färgning har utförts av Wu<em&gt; Et al.</em&gt; (2007).<sup&gt; 2</sup</p>

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes at JoVE.com

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

<p class="jove_content">Genomet av influensa A-virus består av åtta separata komplex av RNA och proteiner, kallade virala ribonucleoprotein komplex (vRNPs). Detta dokument beskriver rening glycerol lutning och transmissionselektronmikroskopi visualisering av influensa A vRNPs.</p>

Rening och visualisering av influensa A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Förberedelse, rening och karakterisering av lantanider Complexes för användning som kontrastmedel för magnetisk resonanstomografi

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Rening av Hsp104, ett protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Kromatografiska Rening av högaktiv Jäst Ribosomer

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Metod för isolering och identifiering av mRNA, mikroRNA och komponenter protein av ribonukleoprotein komplex från cellextrakt med RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Identification of Protein Complexes in <em>Escherichia coli</em> using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifiering av proteinkomplex i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hjälp Sekventiell rening peptid affinitet i kombination med tandem masspektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

AFM-baserad Kartläggning av de elastiska egenskaperna hos cellväggar: i Tissue, Cellulär och Subcellulära resolutioner

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3

Ett steg Rening av Twin-Strep-märkta proteiner och deras komplex på Strep-Tactin Resin tvärbunden med bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3)

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Snabb Isolering och rening av Mitokondrier För Transplantation Av vävnadsdissociering Och Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Generation och rening av mänskliga INO80 Chromatin Remodeling Komplex och subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...