Name: microinjection of mrna and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.
Uploaded: 2009-05-07T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. at JoVE.com

Arbetet stöddes av NIH och PKD Foundation för att ZS. Alla djurförsök har utförts enligt Yale Animal Resources Center (YARC) och Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) riktlinjer.

Del 1: Förberedelse av mikropipetter och mikroinjektion tallrikar kammare <ol><li> Tillverka mikropipetter genom uppvärmning och dra borosilikatglas kapillärrör (World precisionsinstrument, Inc., 1B100-4) i en mikropipett avdragare enhet (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brun P-97). Förvaras i en petriskål på toppen av liten mängd lera eller tejp. </li><li> Häll 1,5% agaros (American Bioanlytical, Inc., AB00972-00.500) i 1x E3 medelstora plattor gjutna med kilformade tråg som ska fungera som en enkel metod...

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fgf8+pre-mRNA+splicing+with+morpholino+oligos:+a+quantifiable+method+for+gene+knockdown.">Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown.</a> Genesis. 30, 154-156 (2001).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+cilia+genes+as+a+principal+cause+of+cystic+kidney.">A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney.</a> Development. 131, 4085-4093 (2004).</li><li>Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication,+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos.">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103, 403-412 (1988).</li><li>Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression.">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109, 577-584 (1990).</li><li>Culp, P., N&#252;sslein-Volhard, C., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+germ-line+transmission+of+plasmid+DNA+sequences+injected+into+fertilized+zebrafish+eggs.">High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).</li><li>Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+zebrafish+embryo.">The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo.</a> Development. 120, 1791-1798 (1994).</li><li>Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+early+cells+to+the+fate+map+of+the+zebrafish+gastrula.">Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula.</a> Science. 265, 517-520 (1994).</li><li>Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+germ-line+chimeras+in+zebrafish+by+cell+transplants+from+genetically+pigmented+to+albino+embryos.">Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).</li><li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA-1+expression+pattern+can+be+recapitulated+in+living+transgenic+zebrafish+using+GFP+reporter+gene.">GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene.</a> Development. 124, 4105-4111 (1997).</li><li>Murphey, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+screening+in+the+zebrafish.">Small molecule screening in the zebrafish.</a> Methods. 39, 255-261 (2006).</li></ol>

Mikroinjektion i zebrafisk embryon är en väl etablerad och robust teknik för att utforska rollen av en viss gen i utvecklingen. Applikationer inkluderar överuttryck, misexpression och analyser ÖVERVÄLDIGANDE av dina gener av intresse samt epistatisk analys mellan flera gener. Mikroinjektion i zebrafisk har i stor utsträckning använts för att generera transgena djur, och kartlägga cell öde i början blastula embryon 5,6,7,8,9. Dessutom fungerar tillämpningen av denna teknik som ett viktigt steg i a...

Alla andra material som anges i protokollet.

microinjection of mrna and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.

Ett viktigt verktyg för att undersöka rollen av en gen under utvecklingen är förmågan att utföra gen ÖVERVÄLDIGANDE, överuttryck, och studier misexpression. I zebrafisk (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Ger mikroinjektion av RNA, DNA, proteiner, oligonukleotider antisense och andra små molekyler i det växande embryot forskarna en snabb och robust test för att utforska genfunktion<em&gt; In vivo</em&gt;. I denna video-artikel kommer vi visa hur man kan förbereda och microinject<em&gt; In vitro</em&gt; Syntetiseras EGFP mRNA och en translationell-blockerande morpholino oligo mot<em&gt; Pkd2</em&gt;, En gen i samband med autosomal dominant polycystisk njursjukdom (ADPKD), i 1-cell zebrafisk skede embryon. Vi kommer då att analysera framgången med mRNA och morpholino microinjections genom att verifiera GFP uttryck och fenotyp analys. Bred tillämpningar av denna teknik inkluderar genererar transgena djur och groddar-line chimärer, cell-öde kartläggning och gen screening. Häri beskriver vi ett protokoll för överuttryck av EGFP och ÖVERVÄLDIGANDE av<em&gt; Pkd2</em&gt; Av mRNA och morpholino oligonukleotid injektion.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. at JoVE.com

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Mikroinjektion är en väletablerad och effektiv metod för att införa främmande ämnen i befruktade zebrafisk embryon. Här visar vi ett robust mikroinjektion teknik för att utföra mRNA överuttryck och morpholino oligonukleotid genen studier knockdown i zebrafisk.

Mikroinjektion av mRNA och Morpholino oligonukleotider Antisens i Zebrafish embryon.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Mikroinjektion av A. aegypti Embryon Skaffa Transgena myggor

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Mikroinjektion av Zebrafish embryon till Analysera genfunktion

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Två-foton axotomy och Time-lapse konfokala imaging i levande zebrafisk embryon

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

Generera chimär Zebrafish embryon genom transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Två-foton-Based Fotoaktiveringen i Live Zebrafish embryon

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Mikroinjektion av medaka embryon för att användas som en modell genetisk organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Analys av mRNA Nuclear Export Kinetics i däggdjursceller genom mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans i Zebrafish embryon genom Metabola märkning och Bioorthogonal Klicka Kemi

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Aktivering av apoptos genom cytoplasmiska mikroinjektion av cytokrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Metabolisk profil Analys av zebrafisk embryon

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...