Name: microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function
Uploaded: 2009-03-09T00:00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function at JoVE.com

Wij erkennen de leden van de Mably lab en Narie Storer voor hun technische bijstand, en de American Heart Association (NCRP Scientist Development Grant 0635363N) en het National Heart, Lung, and Blood Institute (Grant SCCOR RFA HL02-027) voor de financiering.

Deel 1: productie van eieren en het verzamelen <ol><li> De nacht voorafgaand aan de injectie, het opzetten van de vissen in het fokken van tanks met verdeelschotten op zijn plaats. Ter verhoging van de totale productie van eieren, kunnen vissen worden ingesteld in een verhouding van twee vrouwtjes om een ​​mannetje indien gewenst. </li><li> De volgende ochtend, zet na de kamer lampjes op, trek de verdelers van verschillende tanks en laat ongeveer 20 minuten ongestoord paartijd. </li><li> Met behulp van een zeef, het verzamelen van de eieren van de kweek kooien en spoel ze met ei water. Giet de eieren in een petrischaal met ei water en verwijder onbevruchte eieren en vuil met een transfer pipet. Vis kunnen worden gegroepeerd in grotere tanks om extra rondes van eieren voor injectie te produceren. De timing van ei collectie toe te staan ​​voor een maximale hoeveelheden eieren worden geproduceerd, zonder hen te laten passeren de enkele cel stadium. </li><li> Plaats een microscoop dia in de omgekeerde deksel van een 100mm petrischaal. Gebruik een transferpipet aan line-up van de eieren tegen de zijkant van de glijbaan het vormen van een enkele kolom. Verwijder overtollig water uit het ei dia door het indrukken van een Kimwipe tegen de zijde tegenover de eieren. (Figuur 1A) </li></ol> Deel 2: Naald trekken, laden, en voorbereiding <ol><li> Met een micropipet trekker, trek een 1,0 mm OD glazen capillaire in twee naalden en op te slaan in een 150mm petrischaal door het leggen van meer dan Silly Putty hellingen. Naalden kunnen worden getrokken op voorhand. </li><li> Frictie van de naald met 3 pi van injectie materiaal met behulp van een microloader pipet. Schud de bolus in de richting van de naald totdat er weinig of geen luchtbellen blijven. </li><li> Zet de lucht bron en microinjector. Steek de naald in de microinjector en verzekeren een goede afdichting in het huis. Controleer of de micromanipulator is in een goede positie om voor een breed scala van beweging en aanpassing. Breng de naald in het vlak van uitzicht op de microscoop, hoog boven het podium, en de focus op het dunste deel van de tip. Gebruik een paar scherpe tang knijpen af ​​van de naald op een punt die vertrekt van de naald smal genoeg te doorboren het chorion en het eigeel, maar nog steeds in staat van het leveren van een consistente kraal grootte. Een druppel van minerale olie op een micrometer kan worden gebruikt om het volume van elke injectie te berekenen. Bij injectie in de olie, een kraal met een diameter van 0,1 mm bevat 500 pL van injectie materiaal (figuur 1B); injectie volume van 500 PL of 1nL worden doorgaans gebruikt. Druk het voetpedaal en toezicht op de grootte van de kraal, terwijl het trimmen van de naald en het aanpassen van de injectie druk als dat nodig is. Ideaal injectie volumes zal vullen circa 10% van het ei volume. De kwaliteit van de naald is cruciaal voor zowel het gemak van de injectie en de kwaliteit en consistentie van de resultaten. </li></ol> Deel 3: Injectie <ol><li> Zorg ervoor dat de embryo&#39;s niet ontwikkeld langs de vier-cellig stadium. Idealiter zou embryo&#39;s zijn op de een-cellig stadium. </li><li> Laat de naald naar de kolom van eieren, die de schotel op zijn plaats met uw andere hand. </li><li> Pierce het oppervlak van het chorion en voer de dooier in een vloeiende slag tijdens het kijken voor eventuele breken of scheuren van de dooierzak. Injecteer de injectie materiaal in de dooier (figuur 1C). Vermijd het injecteren van luchtbellen of strekken van de dooier als ofwel kan dodelijk zijn voor het embryo. Werken langs de lijn, pas de druk die nodig is om een ​​consistente kraal grootte en, met behulp van een pipet tip te behouden, verwijder dan de eieren die er onbevruchte of worden vernietigd tijdens de injectie proces. </li><li> Na het voltooien van een kolom van eieren, gebruik dan een zachte stroom van ei water om de geïnjecteerde eitjes te verplaatsen naar een schone petrischaal. Herhalen als nodig is. Houden verschillende uninjected embryo&#39;s als een controle. Aan het eind van dag een, verwijderen dode embryo&#39;s en het registreren van het aantal geïnjecteerde embryo&#39;s. Vervang het ei water in de schaal periodiek om de kans op infectie te verkleinen. </li></ol> Deel 4: Representatieve resultaten Afhankelijk van wat er wordt ingespoten, kunnen embryo&#39;s overleven tegen een lager tarief dan hun uninjected broers en zussen. Gelukkig is het gemakkelijk is om te injecteren grote aantallen van hen, dus dit is zelden een probleem. Het is normaal dat morphants te exposeren licht vertraagde ontwikkeling. Ter illustratie van de resultaten van micro-injectie, gebruikten we dit protocol tot het niveau van het eiwit Hart van Glas (Heg) te manipuleren. HEG is een transmembraan eiwitten die nodig zijn voor een normale ontwikkeling van het hart. Bij gebreke daarvan, embryo&#39;s te ontwikkelen harten met gigantische instroom traktaten en Kamers 1. We hebben twee niet eerder beschreven morpholinos geïnjecteerd tegen HEG, heg_e3i3_egfr1 en heg_e4i4_egfr2, bij een concentratie van 500 uM. Op twee dagen na de bevruchting, de uninjected broer of zus controleert normaal lijken, zoals verwacht (figuur 2A en B). Embryo&#39;s geïnjecteerd met heg_e3i3_egfr1 hebben hersenoedeem (figuur 2C). Hoewel de harten van de meeste van deze morphants hebben morfologie veranderd, hun kamers zijn normaal formaat (figuur 2D). Embryo&#39;s geïnjecteerdmet heg_e4i4_egfr2 vertonen variabele hartafwijkingen. Sommige normaal lijken, terwijl anderen hebben grote instroom landstreken en matig vergroot atria (figuur 2E en F). Het HEG mutant, zoals eerder gemeld een, heeft een enorm vergrote instroom-darmkanaal en het atrium (zie figuur 2G en H). We hebben ook geïnjecteerd wildtype embryo&#39;s met 400 ng / ul mRNA getranscribeerd van de volledige lengte cDNA HEG. Terwijl uninjected controles normaal ontwikkelen (figuur 3A en B), embryo geïnjecteerd met HEG mRNA vertonen een spectrum van fenotypen, variërend van wildtype verschijning aan ernstige cyclopie, verkorting van de belangrijkste lichaam as, necrose van het hoofd en lichaam, en middellijn afwijkingen (figuur 3C en D). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> Figuur 1. Embryo&#39;s worden geïnjecteerd worden opgesteld tegen een microscoop dia in een petrischaal (A). Injectie volume wordt bepaald door het injecteren in de minerale olie op een micrometer. Een injectie volume van 500 pL, die gewoonlijk wordt gebruikt, heeft een diameter van 0,1 mm (B). Onmiddellijk na de injectie, de morfolino-of mRNA is zichtbaar als een onderstrepen plek in de dooier (C). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> Figuur 2. Op twee dagen na de bevruchting, embryo&#39;s uninjected hebben geen grove gebreken (A) of hart-fenotype (B). Embryo&#39;s geïnjecteerd met het morfolino heg_e3i3_egfr1 hebben hersenoedeem (C, pijl) maar normaal formaat hartkamers (D). Sommige embryo geïnjecteerd met het morfolino heg_e4i4_egfr2 een vergrote instroom traktaten en atria (E, F). HEG mutanten hebben ernstig vergrote instroom traktaten en atria (G, H). (A), (C), (E), en (G) zijn 4x DIC beelden; (B), (D), (F) en (H) zijn 20x DIC beelden. a = atrium, het = instroom-darmkanaal. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> Figuur 3. Na 24 uur na de bevruchting, embryo&#39;s uninjected hebben een lange, rechte lichaam zonder necrose of middellijn defecten (A) en twee duidelijk omschreven ogen met een neurale buis tussen hen (B). Sommige embryo geïnjecteerd met HEG mRNA, daarentegen, vertonen een verkorte lichaamsas, necrose, misvormde somieten (C), en cyclopie (D). (A) en (C) zijn 4x DIC beelden; (B) en (D) zijn 20x DIC beelden.

<ol>
	<li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish.">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li></ol>

Een van de sterke punten van de zebravis model systeem is het gemak waarmee specifiek gen producten kunnen worden toegevoegd of verwijderd uit het embryo door micro-injectie. Om rode draad overexpressie een bepaald eiwit, het mRNA dat codeert het wordt geïnjecteerd in de dooier op de een-cellig stadium. Tijdens de daaropvolgende van de embryo&#39;s ontwikkeling, wordt het RNA verdeeld over het organisme en vertaald. Omgekeerd, een bepaald eiwit te elimineren, worden morpholinos gebruikt. Morpholinos zijn synthetische oligonucleotiden ontworpen met antisense complementariteit met specifieke RNA&#39;s. Net als mRNA&#39;s worden morpholinos geïnjecteerd in de dooier op de een-cellig stadium. Binnen de embryo ze binden hun doel RNA&#39;s, het voorkomen van vertaling. De belangrijkste wijziging die moet worden gemaakt voor elke morfolino of mRNA is de concentratie van de geïnjecteerde materiaal. Een te hoge concentratie van een van beide morfolino-of mRNA kan leiden tot niet-specifieke toxiciteit, terwijl iedere morfolino moet empirisch worden getest om de optimale concentratie, meestal morfolino concentraties tussen 200 en 500 uM uM bepalen knock down gen-activiteit effectief zonder dat niet-specifieke afwijkingen. De precieze grootte van de naald opening is niet cruciaal. Binnen een bereik van naald maten, inspuitdruk en injectie tijd kan worden aangepast om een ​​bolus van het juiste volume te produceren. Morpholinos hebben vele toepassingen, waaronder de functionele ontleding van domeinen binnen een eiwit. Indien ontworpen voor specifieke exon-intron knooppunten te pakken zal morpholinos voorkomen dat splicing zich voordoet daar. We hebben gekeken naar de effecten van twee morpholinos die zich binden exon-intron knooppunten in het pre-mRNA van HBG. De morfolino heg_e3i3_egfr1 bindt de kruising tussen exon 3 en intron 3, het voorkomen van de splicing machines van integratie van exon 3 tot rijpe transcripten. De morfolino heg_e4i4_egfr2 verwijdert dezelfde exon 4. Zowel de exonen 3 en 4 coderen domeinen die EGF-achtige herhalingen. Sommige embryo geïnjecteerd met heg_e4i4_egfr2 matig phenocopy de mutant, verdere experimenten vereist zal zijn om de rol van de Heg exon 4 in ontwikkeling van het hart te begrijpen. Verrassend, embryo geïnjecteerd met heg_e3i3_egfr1 hebben hersenoedeem, een feature niet gezien in HEG mutanten. Dit kan te wijten zijn aan het vermogen van morpholinos van moeders transcripties dat zou beïnvloed zijn in zygotische mutanten te binden.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PLI 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN 153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P 97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100 F6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader Pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Holder</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>MPH310</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function

Een van de voordelen van het bestuderen van zebravis is het gemak en de snelheid van het manipuleren van eiwit niveaus in het embryo. Morpholinos, die synthetische oligonucleotiden met antisense complementariteit te richten RNA&#39;s, kunnen worden toegevoegd aan het embryo om de expressie van een bepaald gen product te verminderen. Omgekeerd kan verwerkt mRNA worden toegevoegd aan het embryo tot het niveau van een gen product te verhogen. Het voertuig voor het toevoegen van een mRNA of morfolino-tot een embryo is micro-injectie. Micro-injectie is een efficiënte en snelle, waardoor voor de injectie van honderden embryo&#39;s per uur. Deze video laat alle stappen die betrokken zijn bij micro-injectie. Kortom, worden de eieren immediately verzameld na het leggen en gevoerd tegen een microscoop dia in een petrischaal. Vervolgens is een fijne punt naald geladen met injectiemateriaal verbonden aan een microinjector en een lucht-bron, en de microinjector controles worden aangepast om een ​​wenselijke injectie volume te produceren. Ten slotte wordt de naald ondergedompeld in dooier van de embryo&#39;s en de morfolino-of mRNA wordt uitgezet.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function at JoVE.com

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Deze video laat zien hoe morfolino of mRNA kan worden geïnjecteerd in zebravis embryo&#39;s in het een-cellig stadium te verlagen of te verhogen van het niveau van specifieke gen-producten tijdens de verdere ontwikkeling.

Micro-injectie van de zebravis embryo&#39;s Gene functie analyseren

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Micro-injectie van A. aegypti embryo&#39;s om transgene muggen verkrijgen

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Micro-injectie van mRNA en morfolino antisense oligonucleotiden in zebravis embryo&#39;s.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

Het genereren van Chimère zebravis embryo&#39;s door transplantatie

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Met behulp van de optokinetische reactie op de visuele functie van de zebravis studie

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Micro-injectie van Medaka embryo&#39;s voor gebruik als een model organisme Genetische

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Metabole Profiel Analyse van zebravis embryo&#39;s

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Gene Trapping behulp Gal4 in zebravis

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Force Measurement Tijdens Inkrimping naar Muscle Function beoordelen in zebravis Larven

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Hoge resolutie Hele Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in zebravis embryo&#39;s om genexpressie en functie te bestuderen

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...