Name: microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function
Uploaded: 2009-03-09T00:00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function at JoVE.com

אנו מכירים אנשי המעבדה Mably ו Narie סטורר לקבלת סיוע טכני שלהם, איגוד הלב האמריקני (NCRP המדען פיתוח גרנט 0635363N) לבין הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (גרנט SCCOR HL02 RFA-027) למימון.

חלק 1: ייצור ביצה אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלילה לפני זריקה, להגדיר את הדגים רבייה טנקים עם חוצצים במקום. כדי להגדיל את הייצור הכולל ביצה, דגים ניתן להגדיר יחס של שתי נקבות על זכר אחד אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, אחרי האורות בחדר נדלק, למשוך את חוצצים מטנקים מספר ולאפשר כ 20 דקות של זמן הזיווג באין מפריע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מסננת, לאסוף את הביצים מן הכלובים לגידול ולשטוף אותם במים ביצה. יוצקים את הביצים לתוך צלחת פטרי עם מים ביצה מופרית להסיר ביצים ופסולת עם פיפטה העברה. דגים יכולים להיות נערכו מחדש במיכלים גדולים כדי לייצר סיבובים נוספים של ביצים להזרקה. התאם את העיתוי של איסוף ביצים כדי לאפשר מספרים המרבי של ביצים להיות מיוצר מבלי לאפשר להם לעבור את השלב תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום שקופיות מיקרוסקופ במכסה הפוכה של צלחת פטרי 100mm. השתמש פיפטה להעביר בשורה את הביצים על הצד של המגלשה להרכיב עמודה בודדת. הסרה של עודפי מים ביצה משקופית על ידי לחיצה Kimwipe נגד הצד הנגדי הביצים. (איור 1A) </li></ol> חלק 2: משיכת המחט, טעינה, והכנת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם חולץ micropipette, למשוך כוס 1.0mm OD נימי לשתי מחטים חנות בצלחת פטרי 150mm ידי הנחת מעל רמפות מרק טיפשי. מחטים יכול להיות משך מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחט Backload עם μL 3 של חומר ההזרקה באמצעות פיפטה microloader. נער את בולוס לעבר קצה המחט עד כמה יש בועות או לא הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור האוויר microinjector. הכנס את המחט לתוך microinjector ולהבטיח חותם חזק בתוך הדיור. בדוק micromanipulator נמצא במצב תקין כדי לאפשר מגוון רחב של תנועה והסתגלות. תביאו את קצה מחט לתוך מטוס המבט של מיקרוסקופ, גבוה מעל הבמה, להתמקד באזור הדק של קצה. השתמש זוג מלקחיים חדה לצבוט את מחט בנקודה אשר משאיר המחט צר מספיק כדי לחדור את סיסית וחלמון אבל עדיין מסוגל לספק גודל חרוז עקבי. טיפה של שמן מינרלי על מיקרומטר ניתן להשתמש כדי לחשב את עוצמת הקול של כל הזרקה. כאשר מוזרק לתוך השמן, חרוז בקוטר של 0.1 מ&quot;מ מכיל 500 PL של חומר ההזרקה (1B דמות); כרכים הזרקה של 500 PL או 1nL משמשים בדרך כלל. לדכא את דוושת רגל ולנטר את גודל חרוז בעוד זמירה את המחט והתאמת לחץ ההזרקה לפי הצורך. כרכים הזרקת אידיאלי תמלא כ 10% מנפח הביצה. איכות קצה מחט הוא חיוני כדי להקל על שניהם הזרקת ואת איכות ועקביות של התוצאות. </li></ol> חלק 3: הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא העוברים לא התפתחו מעבר לשלב ארבע התא. באופן אידיאלי, עוברים צריך להיות בשלב אחד התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את המחט לכיוון הטור של ביצים, מחזיק את המנה במקום עם היד מול שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירס את פני השטח של סיסית והזן את החלמון במכה אחת חלקה תוך כדי צפייה לכל ריסוק או קריעה של שק החלמון. להזריק את חומר הזרקה לתוך החלמון (דמות 1C). הימנע הזרקת בועות אוויר או מתיחת חלמון כמו גם יכול להיות קטלני לעובר. עבודה לאורך הקו, להתאים את הלחץ הדרוש כדי לשמור על גודל חרוז עקבית, באמצעות קצה פיפטה, להסיר ביצים שנראים מופרית או נהרסים בתהליך הזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת עמודה של ביצים, להשתמש בזרם עדין של מים ביצה להעביר את הביצים מוזרק לתוך צלחת פטרי נקי. חזור על פי הצורך. שמור עוברים uninjected מספר כביקורת. בסוף של יום אחד, להסיר עוברים מתים להקליט את מספר העוברים מוזרק. החלף את המים ביצה בצלחת מעת לעת כדי להקטין את הסיכוי לזיהום. </li></ol> חלק 4: תוצאות נציג תלוי מה זה להיות מוזרק, העוברים עשויים לשרוד בקצב נמוך יותר מאשר אחים uninjected שלהם. למרבה המזל, קל להזריק מספרים עצומים של אותם, אז זה רק לעתים נדירות בעיה. זה נורמלי morphants להציג הפיתוח מתעכב מעט. כדי להמחיש את התוצאות של microinjection, השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לתפעל את רמות החלבון הלב של זכוכית (Heg). Heg הוא חלבון הטרנסממברני הדרושים לפיתוח לב נורמלי. בהעדר שלה, עוברים לפתח לבבות עם קטעי יבוא ענק ותאי 1. אנו מזריקים two morpholinos מתואר בעבר נגד heg, heg_e3i3_egfr1 ו heg_e4i4_egfr2, בריכוז של 500 מיקרומטר. בשלב ההפריה 2 ימים הודעה, שולט אח uninjected נראים תקינים, כצפוי (2A דמות ו-B). עוברים הזריקו heg_e3i3_egfr1 יש בצקת במוח (דמות 2C). למרות ליבם של רוב morphants אלה שינו את המורפולוגיה, חדרי שלהם הם בגודל רגיל (דמות 2D). עוברים מוזרקעם heg_e4i4_egfr2 מומים בלב התערוכה משתנה. חלקם נראים תקינים, בעוד אחרים יש שטחים גדולים יבוא אטריה מוגדל בינוני (2E דמות ו-F). מוטציה heg, כפי שדווח בעבר 1, יש דרכי יבוא מוגדל עצומה ו אטריום (דמות 2G ו-H). אנחנו גם עוברים wildtype מוזרק עם mRNA 400 ng / μL עיבד מ heg באורך מלא cDNA. אמנם שולטת uninjected להתפתח בצורה תקינה (איור 3A ו-B), עוברים הזריקו heg mRNA בתערוכה מגוון של פנוטיפים החל המראה wildtype כדי cyclopia חמור, קיצור של ציר הגוף העיקרי, נמק של הראש והגוף, ועל ליקויים קו האמצע (דמות 3C ו-D). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> באיור 1. לעוברים להיות מוזרק הם נעמדו מול המיקרוסקופ שקופית בצלחת פטרי (A). נפח הזרקה נקבעת על ידי הזרקה לתוך שמן מינרלי דגש על מיקרומטר. נפח הזרקה של 500 PL, אשר נמצא בשימוש נפוץ, בעל קוטר של 0.1 מ&quot;מ (B). מיד לאחר ההזרקה, morpholino או mRNA נראה כמו מקום להדגיש את החלמון (C). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> איור 2. בשלב ההפריה 2 ימים הודעה, עוברים uninjected אין פגמים ברוטו (א) או הפנוטיפ לב (B). עוברים מוזרק עם heg_e3i3_egfr1 morpholino יש בצקת במוח (C, חץ) אבל חדרי הלב בגודל רגיל (D). כמה עוברי מוזרק עם heg_e4i4_egfr2 morpholino יש קטעי זרימה מוגדלים אטריה (E, F). מוטנטים heg יש קטעי יבוא מוגדל קשה אטריה (G, H). (א), (ג), (E), ו - (G) הם תמונות DIC 4x, (ב), (ד), (F) (H) הם 20x תמונות DIC. אטריום = זה = בדרכי יבוא. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> איור 3. הפריה בגיל 24 שעות לכתוב, uninjected עוברי יש גוף ארוך, ישר, ללא פגמים או נמק קו האמצע (א) ושתי עיניים מוגדרים בבירור עם צינור עצביים ביניהם (B). כמה עוברי הזריקו mRNA heg, לעומת זאת, התערוכה ציר הגוף מקוצר, נמק, somites מעוותות (ג), ו cyclopia (ד &#39;). (א) ו - (ג) הם תמונות DIC 4x, (ב) ו - (ד) הם 20x תמונות DIC.

<ol>
	<li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish.">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li></ol>

אחד היתרונות של מערכת מודל דג הזברה הוא הקלות בה מוצרי גן מסוים ניתן להוסיף או לבטל מן העובר על ידי microinjection. כדי בכל מקום בגוף overexpress חלבון מסוים, קידוד ה-mRNA הוא מוזרק לתוך החלמון בשלב 1-התא. במהלך הפיתוח הבאים של העובר, RNA מופץ ברחבי האורגניזם ותורגם. לעומת זאת, כדי למנוע חלבון מסוים, morpholinos משמשים. Morpholinos הם oligonucleotides סינתטי נועד עם ההשלמה antisense כדי RNAs ספציפיים. כמו mRNAs, morpholinos מוזרקים לתוך החלמון בשלב 1-התא. בתוך העובר הם נקשרים RNAs היעד שלהם, למנוע תרגום. השינוי העיקרי צריך להיעשות עבור כל morpholino או mRNA הוא הריכוז של החומר המוזרק. גבוה מדי ריכוז או morpholino או mRNA עלול לגרום אי - רעילות ספציפיים, בעוד כל morpholino חייבים להיבדק אמפירית כדי לקבוע ריכוז אופטימלי שלה, בדרך כלל ריכוזי morpholino בין 200 מיקרומטר ו 500 מיקרומטר להפיל פעילות הגן ביעילות מבלי לגרום אי - פגמים ספציפיים. גודלו המדויק של פתיחת מחט זה לא קריטי. בתוך במגוון גדלים מחט, בלחץ הזרקה וזמן הזרקה ניתן להתאים לייצר בולוס נפח הנכון. Morpholinos יש יישומים רבים, כולל לנתיחה התפקודית של תחומים בתוך החלבון. כאשר תוכנן יעד ספציפי, אקסון אינטרון צמתים, morpholinos תמנע שחבור התרחשות שם. בדקנו את ההשפעה של שתי morpholinos אשר נקלטות אקסון אינטרון צמתים ב-mRNA מראש של heg. Heg_e3i3_egfr1 morpholino נקשר הצומת בין אקסון אינטרון 3 ו 3, מניעת מכונות שחבור מתוך שילוב של אקסון 3 לתוך תמלילי בוגרת. Heg_e4i4_egfr2 morpholino דומה מסיר אקסון 4. שני אקסונים 3 ו -4 לקודד תחומים המכיל EGF כמו חוזר. עוברים כמה הזריקו heg_e4i4_egfr2 בינוני phenocopy מוטציה; ניסויים נוספים יידרשו להבין את התפקיד של Heg אקסון 4 בהתפתחות הלב. באופן מפתיע, עוברים הזריקו heg_e3i3_egfr1 יש בצקת במוח, תכונה לא ראיתי מוטציות heg. זה יכול להיות בגלל היכולת של morpholinos להיקשר תמלילי אימהית זה יהיה מעושה מוטנטים zygotic.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PLI 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN 153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P 97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100 F6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader Pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Holder</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>MPH310</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function

אחד היתרונות של דג הזברה לומד הוא הקלות והמהירות של מניפולציה רמות החלבון בעובר. Morpholinos, אשר oligonucleotides סינתטי עם ההשלמה antisense כדי RNAs היעד, ניתן להוסיף את העובר כדי לצמצם את הביטוי של גן מסוים המוצר. לעומת זאת, ה-mRNA מעובד ניתן להוסיף העובר להגדיל את רמות של המוצר גן. הרכב להוספת או mRNA או morpholino לעובר הוא microinjection. Microinjection יעילה ומהירה, המאפשרת הזרקה של מאות עוברים לשעה. וידאו זה מציג את כל השלבים הכרוכים microinjection. בקצרה, ביצים נאספים מיד אחרי שהרימו אותו בשורה נגד המיקרוסקופ שקופית בצלחת פטרי. בשלב הבא, מחט קנס שקצהו עמוסה חומר הזרקה מחובר microinjector ומקור אוויר, שולט microinjector מותאמים לייצר נפח הזרקה רצוי. לבסוף, המחט הוא צלל לתוך החלמון של העובר ואת morpholino או mRNA הוא גורש.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function at JoVE.com

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

וידאו זה מראה כיצד morpholino או mRNA יהיה ניתן להזריק לתוך עוברי דג הזברה בשלב אחד התא כדי להגדיל או להקטין את רמת המוצרים גן מסוים במהלך ההתפתחות הבאים.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Microinjection עוברים א aegypti לקבל יתושים טראנסגנטי

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

שימוש בתגובה optokinetic ללמוד לתפקד החזותי של דג הזברה

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Microinjection עוברים Medaka לשימוש כמודל אורגניזם גנטי

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

גן השמנה באמצעות Gal4 בדג הזברה

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

מדידת כוח במהלך התכווצות כדי להעריך את תפקוד שריר בזחלי דג הזברה

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

ניתוח של אפופטוזיס בעוברי דג הזברה על ידי כל הר Immunofluorescence לזיהוי caspase הופעל 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...