Name: microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function
Uploaded: 2009-03-09T00:00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function at JoVE.com

Мы признаем, члены Мабли лаборатории и Narie Сторера за техническую помощь, а также Американской ассоциации сердца (НКРЗ Ученый грантов на цели развития 0635363N) и Национальный институт сердца, легких и крови институт (грант SCCOR RFA HL02-027) для финансирования.

Часть 1: производство яиц и сбор <ol><li> Ночь перед инъекцией, созданная в разведении рыбы танков с разделителями на месте. Для увеличения общего объема производства яйца, рыба может быть создан в отношения двух женщин к одному мужчине, если это необходимо. </li><li> На следующее утро, после комнате свет включается, тянуть делителей из нескольких танков и позволяют в течение примерно 20 минут спокойно время спаривания. </li><li> Использование фильтра, собирать яйца из садки и ополосните их водой с яйцом. Вылейте яйца в чашке Петри с яйцом водой и удалить неоплодотворенные яйца и мусор с передачей пипетки. Рыба может быть перегруппированы в больших резервуарах для получения дополнительных раундов яйца для инъекций. Отрегулируйте сроки сбора яиц, чтобы обеспечить максимальное число яиц к производству, не давая им пройти одну стадию клетки. </li><li> Место стекло микроскопа в перевернутую крышку 100 мм чашки Петри. Использование передачи пипетки выстроить яйца к стенке слайд формирования одном столбце. Удалите излишки воды яйцо из слайдов, нажав Kimwipe против стороны, противоположной яйца. (Рис. 1А) </li></ol> Часть 2: игла тянет, погрузка, и подготовка <ol><li> С съемник микропипетки, тянуть 1,0 мм стекло OD капилляр в две иглы и хранить в 150 мм чашки Петри, заложив за глупые рампы шпаклевки. Иглы можно вытянуть вперед. </li><li> Backload игла с 3 мкл инъекции материала с помощью пипетки microloader. Встряхните болюсного в сторону кончика иглы, пока Есть мало или совсем нет пузырьков осталось. </li><li> Включите источник воздуха и microinjector. Вставьте иглу в microinjector и обеспечения герметичности внутри корпуса. Убедитесь, что микроманипулятора находится в правильном положении, чтобы обеспечить широкий диапазон движений и корректировки. Принесите иглы в плоскости зрения микроскопа, высокая со сцены, и сосредоточиться на тонкой области кончика. Используйте пару острых щипцов, чтобы отщипывать иглу в точке, которая выходит из иглы достаточно узкими, чтобы проникнуть хориона и желток, но все еще способных доставлять соответствует размер гранул. Капли нефтепродуктов на микрометр может быть использована для расчета объема каждой инъекции. При попадании в масло, шарик с диаметром 0,1 мм содержит 500 ФЛ инъекции материала (рис. 1б); инъекции объемах 500 рь или 1nL обычно используются. Нажмите на педаль и контролировать размер шарик урезая иглы и регулировки давления впрыска по мере необходимости. Идеально объемы инъекций заполнят около 10% объема яйца. Качество иглы имеет решающее значение для обеих легкость впрыска и качество и согласованность результатов. </li></ol> Часть 3: инъекция <ol><li> Обеспечить эмбрионов не разработали прошлого четыре-клеточной стадии. В идеале, эмбрионы должны быть на один-клеточной стадии. </li><li> Опустите иглу в сторону колонки яиц, держа блюдо в месте с противоположной стороны. </li><li> Пирс поверхности хориона и введите желток в одной плавности хода во время просмотра для любого дробления или разрыв желточного мешка. Inject инъекции материала в желтке (рисунок 1С). Избегайте инъекционных пузырьков воздуха или растяжения желтка, как любой из них может быть смертельным для эмбриона. Рабочие вниз линию, отрегулировать давление, необходимое для поддержания последовательного размер гранул и, используя наконечник пипетки удалить яйца, которые выглядят неоплодотворенные или разрушены во время процесса впрыска. </li><li> После завершения колонке яйца, использовать струю воды яйца, чтобы переместить вводят яйца в чистую чашку Петри. При необходимости повторите. Держите несколько uninjected эмбрионов в качестве контроля. В конце первого дня, удалить мертвые эмбрионы и записи количества вводимого эмбрионов. Замените яйцо вода в блюдо периодически, чтобы уменьшить вероятность заражения. </li></ol> Часть 4: Представитель результаты В зависимости от того, что вводится, эмбрионы могут выжить по более низкой ставке, чем их uninjected братьев и сестер. К счастью, это легко вводится огромное количество из них, так это редко является проблемой. Это нормально для morphants проявлять небольшая задержка развития. Для иллюстрации результатов микроинъекции, мы использовали этот протокол для управления уровнем белка Heart Of Glass (HEG). HEG это трансмембранный белок, необходимый для нормального развития сердца. В его отсутствие, эмбрионы развиваться сердца с гигантскими путей притока и камер 1. Мы вводили два не описанных morpholinos против хег, heg_e3i3_egfr1 и heg_e4i4_egfr2, в концентрации 500 мкМ. В 2 дней после оплодотворения, uninjected управления брат кажутся нормальными, как и ожидалось (2А фигурой и B). Эмбрионы вводили heg_e3i3_egfr1 есть отек мозга (рис. 2С). Хотя сердцах большинства этих morphants изменили морфологии, их камеры, как правило, размером (рис. 2D). Эмбрионы вводилис heg_e4i4_egfr2 выставку переменная пороков сердца. Некоторые выглядят нормальными, а другие имеют большие участки притока и умеренно увеличена предсердий (2E фигура и F). Хег мутант, как сообщалось ранее 1, имеет чрезвычайно увеличены путей притока и предсердия (рис. 2G и H). Мы также вводили дикого типа эмбрионов с 400 нг / мкл РНК транскрибируется из полнометражных хег кДНК. Хотя uninjected управления развиваются нормально (рис. 3А и В), эмбрионы вводят хег мРНК выставку спектра фенотипов от дикого типа внешности тяжелой циклопии, укорочение главной оси тела, некроз голову и тело, и средняя линия дефектов (рис. 3C и D). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> Рисунок 1. Эмбрионы, который будет введен выстроились против стекло микроскопа в чашке Петри (А). Инъекция объем определяется путем введения в минеральное масло размещены на микрометр. Объемом впрыска от 500 PL, который обычно используется, имеет диаметр 0,1 мм (В). Сразу же после инъекции, морфолино или мРНК видна как точечный пятна в желтке (С). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> Рисунок 2. В 2 дней после оплодотворения, uninjected эмбрионы не имеют валовой дефектов () или сердечный фенотипа (В). Эмбрионы вводили морфолино heg_e3i3_egfr1 есть отек мозга (С, стрелка), но, как правило размеров камер сердца (D). Некоторые эмбрионы вводят морфолино heg_e4i4_egfr2 расширили путей притока и предсердий (E, F). хег мутантов серьезно увеличить приток путей и предсердий (G, H). (A), (C), (E) и (G) являются 4x DIC изображений; (Б), (D), (F) и (Н) 20x DIC изображений. атриум =, = это приток тракта. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> Рисунок 3. Через 24 часа после оплодотворения, uninjected эмбрионы имеют длинные, прямые тело без некроза или средней линии дефектов () и две четко определенные глаза нервной трубки между ними (B). Некоторые эмбрионы вводят хег мРНК, напротив, обладают укороченной оси тела, некроз, misshaped сомитов (С), и циклопии (D). (А) и (С) 4x DIC изображений; (Б) и (D) имеют 20-кратный DIC изображений.

<ol>
	<li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish.">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li></ol>

Одной из сильных сторон модели системы данио является легкость, с которой определенные продукты генов могут быть добавлены или исключены из эмбриона путем микроинъекции. Чтобы повсеместно гиперэкспрессией частности белка, мРНК, кодирующей ее закачивают в желтке на 1-клеточной стадии. Во время последующего развития эмбриона, РНК, распространяется по всему организму и переводится. С другой стороны, для устранения того или иного белка, morpholinos используются. Morpholinos синтетические олигонуклеотиды разработан с антисмысловых взаимодополняемости конкретных РНК. Как мРНК, morpholinos вводят желток на 1-клеточной стадии. Внутри эмбриона они связывают свои РНК мишени, предотвращение перевода. Основные изменения, которые необходимо сделать для каждого морфолино или мРНК концентрации вводимого материала. Слишком высокая концентрация либо морфолино или мРНК может вызвать неспецифические токсичности, в то время как каждый морфолино должно быть проверено эмпирически определить его оптимальную концентрацию, как правило, морфолино концентрациях от 200 мкМ и 500 мкМ сбить активность генов эффективно, не вызывая неспецифические дефекты. Точный размер иглы открытие не является решающим. В диапазоне размеров иглы, давление впрыска и время впрыска может быть отрегулирована для производства болюс правильный объем. Morpholinos имеют много приложений, в том числе функциональной рассечение доменов в белке. Когда предназначены для решения конкретных экзон-интрон переходы, morpholinos будет препятствовать сращивания от происходящих в нем. Мы исследовали влияние двух morpholinos, которые связывают экзон-интрон переходов в пре-мРНК из хег. Морфолино heg_e3i3_egfr1 связывает стыке экзонов 3 и интрон 3, предотвращения сращивания машины от включения экзона 3 в зрелые транскриптов. Морфолино heg_e4i4_egfr2 так же удаляет экзон 4. Оба экзонов 3 и 4 кодировать доменов, содержащих ЭФР-подобных повторов. Некоторые эмбрионы вводят heg_e4i4_egfr2 умеренно фенокопии мутант, дальнейшие эксперименты будут необходимы для понимания роли HEG экзона 4 в развитии сердца. Удивительно, но эмбрионы вводят heg_e3i3_egfr1 есть отек мозга, функция не видел в хег мутантов. Это может быть связано со способностью связывать morpholinos материнской стенограмм, которые будут затронуты в зиготических мутантов.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PLI 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN 153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P 97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100 F6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader Pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Holder</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>MPH310</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function

Одним из преимуществ изучения данио является простота и скорость манипуляции белка в зародыше. Morpholinos, которые синтетических олигонуклеотидов с антисмысловых комплементарности целевой РНК, могут быть добавлены в эмбрион сократить выражение того или иного продукта гена. С другой стороны, обрабатываются мРНК могут быть добавлены в эмбрион увеличить уровни генного продукта. Средство для добавления или мРНК или морфолино на эмбрион микроинъекции. Микроинъекция является эффективным и быстрым, позволяя инъекции сотен эмбрионов в час. Это видео показывает все этапы микроинъекции. Короче говоря, яйца собираются сразу после увольнения и выстроились против стекло микроскопа в чашке Петри. Далее, с острым концом иглы загружается с впрыском материала связано с microinjector и источником воздуха и microinjector управления настраиваются для получения желаемого объема инъекции. Наконец, игла погружается в желтке зародыша и морфолино или мРНК изгнаны.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function at JoVE.com

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Это видео показывает, как морфолино или мРНК может быть введен в данио эмбрионов на один-клеточной стадии для уменьшения или увеличения уровня специфических генных продуктов в течение последующего развития.

Микроинъекции данио рерио Эмбрионы для анализа функции гена

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Микроинъекция А. Эмбрионы aegypti получить Трансгенные комары

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Микроинъекция мРНК и Олигонуклеотиды морфолино антисмысловых в данио рерио эмбрионов.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

Создание химерных эмбрионов данио рерио по трансплантации

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Использование optokinetic ответ на исследование зрительной функции данио

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Микроинъекция эмбрионов оризии для использования в качестве модели Генетические организма

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Метаболический Анализ профиля эмбрионов данио рерио

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Джин Захват Использование Gal4 в данио рерио

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Измерение силы при сжатии для оценки функции мышц в личинки данио

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Высокое разрешение Всего горе<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в Эмбрионы рыбок данио изучить экспрессию генов и функции

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Анализ апоптоза у эмбрионов данио рерио по целом монтажа иммунофлуоресценции для обнаружения активированного каспазы 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...