Name: two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos
Uploaded: 2009-02-16T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos at JoVE.com

Nous remercions Mark Terasaki pour des conseils initiaux sur l&#39;aide d&#39;un microscope à deux photons pour créer des lésions tissulaires locales, Kathy Joubin des conseils sur le montage d&#39;imagerie time-lapse, et les laboratoires Sagasti et Portera-Cailliau pour les discussions. Les premières expériences ont été effectuées par l&#39;AS en tant que boursier de la Fondation à l&#39;herbe Labs de biologie marine de Woods Hole, MA. Le travail dans le laboratoire Sagasti a été soutenue par des subventions de la Fondation de Whitehall, la Fondation Klingenstein, et un prix du Burroughs Wellcome Fund carrière dans les sciences biologiques.

Partie 1: Montage embryons de poissons zèbres à long terme d&#39;imagerie <ol><li> Préparer 1% d&#39;agarose Low Melt solution pour incorporer. Dissoudre dans de l&#39;eau DI agarose par chauffage dans un four micro-ondes, partie aliquote dans des tubes de petits et de stocker dans un bloc chauffant à 42 degrés Celsius. </li><li> Sélectionnez embryons à des fins d&#39;imagerie et d&#39;enlever leurs chorions en tirant doucement sur le chorion dehors avec une pince. Les embryons peuvent être placés dans une so...

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	<li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors.">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery.">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li></ol>

Nous avons utilisé les méthodes décrites avec précision axotomize périphériques axones sensoriels et d&#39;observer directement la régénération chez l&#39;embryon de poisson zèbre vivant. À long terme time-lapse imagerie confocale chez le poisson zèbre peut être utilisé pour observer les nombreux processus développementaux in vivo. La procédure axotomie deux photons décrit peut être modifié pour de nombreuses différentes objectifs expérimentaux. Nous avons utilisé la même procédure gén?...

two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Le poisson zèbre ont longtemps été utilisés pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement en imagerie time-lapse de l&#39;embryon vivant transparente. Nous décrivons ici une méthode pour monter embryons de poissons zèbres à long terme d&#39;imagerie et de démontrer comment automatiser la capture de time-lapse images à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal. Nous décrivons également une méthode pour créer contrôlée, des dommages précis pour chaque branche d&#39;axones sensoriels périphériques chez le poisson zèbre en utilisant la puissance centrée sur un laser femtoseconde monté sur un microscope à deux photons. Les paramètres pour la réussite à deux photons axotomie doit être optimisé pour chaque microscope. Nous allons démontrer à deux photons axotomie la fois sur une mesure construite à deux photons microscope et d&#39;un Zeiss 510 / confocale à deux photons pour fournir deux exemples. Zebrafish trijumeau neurones sensoriels peuvent être visualisées dans une ligne de transgéniques exprimant la GFP conduit par un promoteur neurone sensoriel spécifique 1. Nous avons adapté ce modèle de poisson zèbre trijumeau d&#39;observer directement la régénération des axones sensoriels dans la vie des embryons de poisson zèbre. Les embryons sont anesthésiés avec tricaïne et positionnée dans une goutte d&#39;agarose comme il se solidifie. Immobilisé embryons sont scellés dans une chambre remplie d&#39;imagerie phénylthiourée (PTU) de Ringer. Nous avons constaté que les embryons peuvent être continuellement imagée dans ces chambres pour les 12-48 heures. Une seule image confocale est alors capturé afin de déterminer l&#39;endroit désiré de axotomie. La région d&#39;intérêt est située sur le microscope à deux photons par imagerie par les axones sensoriels sous faible, non dommageable pouvoir. Après un zoom avant sur le site désiré de axotomie, la puissance est augmentée et un seul balayage de cette région définie est suffisante pour rompre l&#39;axone. Plusieurs emplacement imagerie time-lapse est alors mis en place sur un microscope confocal d&#39;observer directement la récupération d&#39;une blessure axonale.

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Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Nous décrivons ici une méthode pour le montage embryons de poissons zèbres à long terme d&#39;imagerie, l&#39;imagerie à deux photons et les tissus des dommages-techniques, et time-lapse imagerie confocale.

Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Recherche

Biologie

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

La transplantation de blastomères exprimant la GFP pour l&#39;imagerie en direct sur le développement de la rétine et du cerveau dans les embryons de poissons zèbres chimériques

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

Multicolor imagerie time-lapse de poisson zèbre transgénique: Visualisation des cellules souches rétiniennes Activé par ablation cellulaire ciblée neuronale

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse de microscopie du début de l&#39;embryogenèse dans les Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Basées sur la fluorescence de mesure de l&#39;entrée du calcium magasin fonctionnant dans des cellules vivantes: à partir de cellules cancéreuses en culture de fibre musculaire squelettique

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

L&#39;utilisation de la microscopie à Time Lapse Visualisez anoxie induite Suspended Animation en<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryons

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

À long terme, à haute résolution d&#39;imagerie confocal Time Lapse d&#39;<em&gt; Cotylédon Arabidopsis</emEpiderme&gt; cours de germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...