Name: two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos
Uploaded: 2009-02-16T00:00:00
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Wir danken Mark Terasaki für Erstberatung mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop, um lokale Gewebeschäden, Kathy Joubin um Rat Halterung für Zeitraffer-Imaging und der Sagasti und Portera-Cailliau Labors für Diskussionen zu schaffen. Erste Versuche wurden von AS als Grass Foundation Fellow am Marine Biological Labs in Woods Hole, MA durchgeführt. Die Arbeit im Labor war Sagasti durch Zuschüsse aus dem Whitehall-Stiftung, die Klingenstein Foundation, und ein Burroughs Wellcome Fund Career Award in den biologischen Wissenschaften unterstützt.

Teil 1: Montieren Zebrafischembryonen für langfristige Bildgebung <ol><li> Bereiten Sie 1% niedrig schmelzende Agarose-Lösung für die Einbettung. Lösen Sie Agarose in DI-Wasser durch Erhitzen in der Mikrowelle, Aliquot in kleine Röhrchen und lagern in einem Heizblock bei 42 Grad Celsius. </li><li> Wählen Embryonen für die Bildgebung und entfernen ihre Chorion durch leichtes Ziehen des Chorion auseinander mit einer Pinzette. Embryonen können in eine 5% PTU Ringers Lösung bei 22-24 Stunden nach der Befruchtung ...

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	<li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors.">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery.">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li></ol>

Wir haben die Methoden beschrieben, um genau axotomize peripheren sensorischen Axonen und direkt zu beobachten Regeneration im lebenden Zebrafisch-Embryos verwendet. Langfristige Zeitraffer-konfokale Bildgebung in Zebrafisch kann verwendet werden, um viele Entwicklungsprozesse in vivo zu beobachten. Die Zwei-Photonen-Axotomie beschriebene Verfahren kann für viele verschiedene experimentelle Ziele modifiziert werden. Wir haben die gleiche allgemeine Verfahren zur gesamten Trigeminus sensorischen Neurons Zellkö...

two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafische sind seit langem verwendet, um die zellulären und molekularen Mechanismen der Entwicklung von Zeitraffer-Bildgebung des lebendigen transparent Embryo zu studieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Zebrafisch-Embryos für die langfristige Bildgebung montieren und zu demonstrieren, wie die Erfassung von Zeitraffer-Aufnahmen mit einem konfokalen Mikroskop zu automatisieren. Wir beschreiben eine Methode, um den kontrollierten, präzisen Schäden an einzelnen Zweigen der peripheren sensorischen Axone im Zebrafisch mit dem Schwerpunkt Kraft eines Femtosekunden-Laser auf einem Zwei-Photonen-Mikroskop montiert erstellen. Die Parameter für eine erfolgreiche Zwei-Photonen-Axotomie muss für jedes Mikroskop optimiert werden. Wir werden Zwei-Photonen-Axotomie sowohl auf custom built Zwei-Photonen-Mikroskop und einem Zeiss 510 konfokalen / Zwei-Photonen auf zwei Beispiele geben zu demonstrieren. Zebrafisch Trigeminus sensorischen Neuronen können in einer transgenen Linie, die GFP durch ein sensorisches Neuron spezifischen Promotor 1 angetrieben visualisiert werden. Wir haben diese Zebrafisch Trigeminus-Modell angepasst, um direkt zu beobachten sensorischen Axonregeneration in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Die Embryonen werden betäubt mit Tricaine positioniert und in einem Tropfen Agarose als sie erstarrt. Immobilisierte Embryonen werden in einem bildgebenden Kammer mit Phenylthioharnstoff (PTU) Ringers gefüllt versiegelt. Wir haben festgestellt, dass Embryonen kontinuierlich in diesen Kammern werden für 12-48 Stunden abgebildet. Ein einziger konfokalen Bild wird dann erfasst, um die gewünschte Stelle des Axotomie bestimmen. Die Region von Interesse ist auf der Zwei-Photonen-Mikroskop durch die Abbildung der sensorischen Axone bei niedrigen, nicht-schädliche Macht entfernt. Nach dem Zoomen in die gewünschte Stelle des Axotomie, wird die Leistung erhöht und einen einzigen Scan des definierten Bereichs ist ausreichend, um das Axon zu durchtrennen. Mehrere Lage Zeitraffer-Imaging wird dann auf einem konfokalen Mikroskop direkt beobachten axonalen Erholung von Verletzungen gesetzt.

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Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Montage Zebrafischembryonen für langfristige Bildgebung, Zwei-Photonen-Imaging-und Gewebe-Schaden Techniken und Zeitraffer-konfokale Bildgebung.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Forschung

Biologie

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zur Anoxie-induzierten Suspended Animation in Visualisieren<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryonen

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis während der Keimung

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...