Name: two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos
Uploaded: 2009-02-16T00:00:00
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我々は議論をタイムラプスイメージングのための取付けに関するアドバイスはキャシージュバン、地元の組織の損傷を作成するには、二光子顕微鏡を用いて上での最初のアドバイスのためにマーク寺崎に感謝、そしてSagastiとPortera - Cailliauラボ。初期の実験は、ウッズホール、マサチューセッツ州の海洋生物学研究所のグラス財団のフェローとして、ASによって行われた。 Sagastiラボの仕事はホワイト財団、Klingenstein財団、生物科学におけるバローズウェルカム基金のキャリア賞からの補助金によって支えられている。

パート1：長期的イメージングのための取付ゼブラフィッシュ胚<ol><li>埋め込みのために1％低融点アガロース溶液を調製。小さなチューブと摂氏42度で加熱ブロックのストアに分注し、マイクロ波で加熱することにより、DI水でアガロースを溶解する。 </li><li>イメージングのための胚を選択して、静かにピンセットで離れて絨毛膜を引っ張って、そのchorionsを削除します。胚は、色素の形成を...

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	<li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors.">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery.">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li></ol>

我々は正確に末梢感覚軸索をaxotomizeすると、直接生活ゼブラフィッシュの胚で再生を観察するために説明する方法を使用している。ゼブラフィッシュにおける長期タイムラプス共焦点イメージングは、 生体内で多くの発達過程を観察するために使用することができます。説明する2つの光子軸索切断の手順は、多くの異なる実験の目的のために変更することができます。我々は、細胞?...

two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

ゼブラフィッシュは、長く生きて透明な胚のタイムラプスイメージングが開発中の細胞および分子メカニズムを研究するために利用されている。ここでは、長期的なイメージングのためのゼブラフィッシュ胚をマウントする方法を説明し、共焦点顕微鏡を用いたタイムラプス画像のキャプチャを自動化する方法を示します。我々はまた、二光子顕微鏡に搭載されたフェムト秒レーザーの集光力を用いてゼブラフィッシュの末梢感覚軸索の個々の枝に制御された、正確なダメージを作成する方法を説明します。成功した二光子軸索切断のためのパラメータは、それぞれの顕微鏡用に最適化されている必要があります。我々は二つの例を提供するためにカスタムされた2光子顕微鏡とツァイス510共焦点/二光子の両方で二光子軸索切断のデモンストレーションを行います。 ゼブラフィッシュの三叉神経感覚ニューロンは、感覚神経特異的プロモーター1によって駆動トランスジェニックラインを発現GFPで可視化することができる。我々は直接ゼブラフィッシュ胚の生体内での感覚軸索再生を観察するためにこのゼブラフィッシュの三叉神経モデルを適応している。それが固化すると胚はtricaineで麻酔し、アガロースのドロップ内に配置。固定された胚は、フェニルチオ尿素（PTU）リンガーズで満たされたイメージングチャンバー内に封入されています。我々は、胚が連続して12から48時間のためにこれらのチャンバーでイメージングできることを見出した。単一の共焦点イメージは、軸索切断の目的のサイトを決定するためにキャプチャされます。関心領域は画像処理による2光子顕微鏡の低、非損傷電力下感覚軸索に位置しています。軸索切断の目的のサイト上で拡大した後、電力が増加し、その定義された領域の単一のスキャンでは、軸索を切断するのに十分です。複数の場所タイムラプスイメージングは​​、直接、負傷から軸索の回復を観察するために共焦点顕微鏡に設定されています。

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Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

ここでは、長期的イメージング、二光子イメージングと組織損傷のテクニック、およびタイムラプス共焦点イメージングのためのゼブラフィッシュ胚を装着するための方法を説明します。

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

細胞運動やゼブラフィッシュ胚における個々の神経細胞と神経堤細胞のアクチン細胞骨格のライブイメージング

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

ライブゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの光活性化

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

キメラゼブラフィッシュ胚における網膜と脳の開発のライブイメージングのためのGFP発現割球の移植

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

トランスジェニックゼブラフィッシュの多色タイムラプスイメージング：標的神経細胞のアブレーションによって活性化を可視化網膜幹細胞

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

における酸素欠乏によって誘導された仮死状態を可視化するために時間の経過顕微​​鏡の使用<em&gt; Cエレガンス</em&gt;胚

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング<em&gt;シロイヌナズナ子葉</em発芽過程&gt;表皮

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...