Name: two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos
Uploaded: 2009-02-16T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos at JoVE.com

Agradecemos a Mark Terasaki para aconselhamento inicial sobre o uso de um microscópio de dois fótons para criar dano tecidual local, Kathy Joubin para aconselhamento sobre a montagem de lapso de tempo de imagem, e os laboratórios Sagasti e portera-Cailliau para as discussões. Experimentos iniciais foram realizados por AS como Fellow da Fundação grama nos laboratórios de Biologia Marinha de Woods Hole, MA. Trabalho no laboratório Sagasti foi suportada por concessões da Fundação Whitehall, a Fundação Klingenstein, e um Burroughs Wellcome Fund Prémio Carreira em Ciências Biológicas.

Parte 1: embriões zebrafish de montagem para longo prazo imagem <ol><li> Prepare 1% agarose baixo derreta solução para a incorporação. Dissolver a agarose em água DI por aquecimento em um forno de microondas, alíquota em pequenos tubos e armazenar em um bloco de aquecimento a 42 graus Celsius. </li><li> Selecionar embriões para geração de imagens e remover seus córions puxando o córion distante com fórceps. Embriões podem ser colocados em uma solução de 5% Ringers PTU em 22-24 horas após a fertilizaç...

<ol>
	<li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors.">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery.">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li></ol>

Nós temos usado os métodos descritos com precisão axotomize periféricos axônios sensitivos e observar diretamente a regeneração no embrião do zebrafish vida. Longo prazo de imagens de lapso de tempo confocal em zebrafish pode ser usado para observar muitos processos de desenvolvimento in vivo. O procedimento axotomia dois fótons descritos podem ser modificadas para muitos diferentes objetivos experimentais. Temos usado o mesmo procedimento geral para extirpar toda trigeminal corpos celulares dos neurô...

two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Peixe-zebra tem sido utilizada para estudar os mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento por lapso de tempo de imagem do embrião vivo transparente. Aqui nós descrevemos um método para montar embriões zebrafish de longo prazo de imagem e demonstrar como automatizar a captura de imagens de lapso de tempo usando um microscópio confocal. Descrevemos também um método para criar danos, controlado precisa para ramos individuais de axônios sensitivos periféricos em zebrafish usando o poder concentrado de um laser de femtosegundos montado em um microscópio de dois fotões. Os parâmetros para axotomia dois fótons de sucesso deve ser otimizada para cada microscópio. Vamos demonstrar dois fótons axotomia em ambos um costume construída microscópio de dois fótons e uma Zeiss 510 / confocal de dois fótons para fornecer dois exemplos. Zebrafish trigeminal neurônios sensoriais podem ser visualizados em uma linha de transgênicos expressando GFP dirigido por um promotor neurônio sensorial específica 1. Nós adaptamos este modelo zebrafish trigeminal para observar diretamente a regeneração do axônio sensorial em que vivem os embriões do zebrafish. Embriões são anestesiados com tricaina e posicionado dentro de uma gota de agarose como ela se solidifica. Embriões imobilizado são selados dentro de uma câmara de imagem cheia de phenylthiourea (PTU) Ringers. Nós descobrimos que os embriões podem ser continuamente trabalhada, nas câmaras de 12-48 horas. A única imagem confocal é então capturado para determinar o local desejado para a axotomia. A região de interesse está localizado no microscópio de dois fotões por imagem os axônios sensoriais em baixa, o poder não-prejudicial. Depois de ampliar no local desejado de axotomia, a potência é aumentada e uma única varredura da região definida é suficiente para romper o axônio. Múltiplas localização de imagens de lapso de tempo é então configurado em um microscópio confocal para observar diretamente a recuperação de uma lesão axonal.

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos at JoVE.com

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Aqui nós descrevemos um método para a montagem de embriões zebrafish de longo prazo de imagem, de dois fótons de imagem e tecidos de danos técnicas e lapso de tempo de imagem confocal.

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologia

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Transplante de GFP-expressando Blastômeros for Imaging ao vivo de Desenvolvimento da retina e do cérebro em embriões Zebrafish Quimérico

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

Multicolor imagem em tempo-lapso de Transgênicos Zebrafish: Visualizando Células-Tronco da retina Ativado por Ablação célula-alvo Neuronal

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Uso de Microscopia Time Lapse para Visualize Anoxia induzida Suspended Animation em<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriões

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Longo prazo, de alta resolução de imagem Lapse Confocal Tempo de<em&gt; Cotilédone Arabidopsis</em&gt; Epiderme durante a germinação

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...