Name: two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos
Uploaded: 2009-02-16T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos at JoVE.com

Vi tackar Mark Terasaki för inledande råd om hur man använder en två-photon mikroskop för att skapa lokala vävnadsskador, Kathy Joubin för råd om montering för time-lapse avbildning och Sagasti och Portera-Cailliau Labs för diskussioner. De första experimenten utfördes av AS som en gräsunderlag Fellow vid marinbiologiska Labs i Woods Hole, MA. Arbetet i Sagasti labbet har finansierats med bidrag från Whitehall Foundation, Klingenstein Foundation och en Burroughs Wellcome Fund Karriär Award inom de biologiska vetenskaperna.

Del 1: Montering zebrafisk embryon för långsiktig imaging <ol><li> Bered 1% lägre smälta agaroslösningen för inbäddning. Lös upp agaros i DI-vatten genom uppvärmning i en mikrovågsugn, alikvot i små tuber och butik i ett värmeblock vid 42 grader Celsius. </li><li> Välj embryon för avbildning och ta bort deras chorions genom att försiktigt dra chorion isär med pincett. Embryon kan placeras i en 5% PTU Ringers lösning vid 22-24 timmar efter befruktning (HPF) för att hämma bildandet av pigment. Detta f...

<ol>
	<li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors.">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery.">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li></ol>

Vi har använt de metoder som beskrivs exakt axotomize perifer sensorisk axoner och att direkt observera förnyelse i den levande zebrafisk embryot. Långfristiga tidsförlopp konfokala imaging i zebrafisk kan användas för att observera många utvecklingsprocesser in vivo. De två-photon axotomy som beskrivs kan modifieras på många olika experimentella mål. Vi har använt samma allmänna förfarandet för att avlägsna hela trigeminus sensoriska organ neuron cell, genom att zooma in på cellkroppen snarare...

two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafisk har länge använts för att studera de cellulära och molekylära mekanismer för utveckling av tidsförlopp avbildning av levande genomskinliga embryot. Här beskriver vi en metod att montera zebrafisk embryon för långsiktig bilder och visa hur man automatiserar tillfångatagandet av tidsförlopp bilder med hjälp av en konfokalmikroskop. Vi beskriver också en metod för att skapa kontrollerade, precisa skador på enskilda grenar av perifer sensorisk axoner i zebrafisk med fokus kraften i en femtosecond laser monterad på en två-photon mikroskop. De parametrar för en lyckad två-photon axotomy måste optimeras för varje mikroskop. Vi kommer att visa två-photon axotomy på både en specialbyggd två-photon mikroskop och en Zeiss 510 konfokala / två-photon att ge två exempel. Zebrafisk trigeminala sensoriska nervceller kan visualiseras i en transgen linje uttrycker GFP drivs av ett sensoriska neuron specifika promotorn 1. Vi har anpassat denna zebrafisk trigeminala modell för att direkt observera sensoriska axon förnyelse i levande zebrafisk embryon. Embryon är bedövas med tricaine och placeras i en droppe agaros som den stelnar. Immobiliserade embryon är förseglad i en avbildning kammare fylld med phenylthiourea (PTU) ringsignaler. Vi har funnit att embryon kontinuerligt kan avbildas på dessa avdelningar för 12-48 timmar. En enda konfokala bild då fångas för att bestämma den önskade platsen för axotomy. Regionen av intresse ligger på två-photon mikroskop genom att avbilda de sensoriska axoner under låga, icke-skadande effekt. Efter att zooma in på den önskade platsen axotomy, är kraften ökade och en scan av den definierade regionen är tillräcklig för att bryta axonet. Flera plats time-lapse avbildning är sedan ställa upp på en konfokalmikroskop att direkt observera axonal återhämtning från skador.

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos at JoVE.com

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Här beskriver vi en metod för montering zebrafisk embryon för långsiktig bildbehandling, två-photon avbildning och vävnads-skador tekniker, och Time-lapse konfokala bildhantering.

Två-foton axotomy och Time-lapse konfokala imaging i levande zebrafisk embryon

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Live avbildning av Zebrafish embryonal hjärna av konfokalmikroskopi

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Bildproduktion för cell motilitet och Actin cytoskelettet av enskilda nervceller och neurala celler Crest i Zebrafish embryon

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Två-foton-Based Fotoaktiveringen i Live Zebrafish embryon

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Transplantation av GFP-uttryckande blastomerer för Live avbildning av näthinnan och hjärnans utveckling hos chimära Zebrafish embryon

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

Multicolor Time-lapse avbildning av Transgena Zebrafish: Visualisering Retinal Stamceller Aktiveras genom riktade neuronal cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Mikroskopi av tidig embryogenesen i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-baserad Mätning av Store-drivs kalcium Entry i levande celler: från odlade Cancer Cell till skelettmuskulatur Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Användning av Time Lapse mikroskopi för att visualisera Anoxia-inducerad skendöd i<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryon

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Långsiktigt hög upplösning Confocal Time lapse avbildning av<em&gt; Arabidopsis Hjärtblad</em&gt; Epidermis under groning

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...