Name: live imaging of dense-core vesicles in primary cultured hippocampal neurons
Uploaded: 2009-05-29T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons at JoVE.com

Wij danken Harald Hutter en Helena Decker voor hun zorgvuldige lezing van dit manuscript. We danken ook Reg Sidhu van Leica Microsystems voor zijn technische expertise. Dit onderzoek werd ondersteund door de National Sciences and Engineering Council of Canada, Award # 327100-06, en de Simon Fraser University faculteit Bètawetenschappen.

Deel 1: Transfectie van neuronen met behulp van Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Apparatuur set-up: Rat of muis hippocampale neuronen worden gekweekt volgens de Kaech en Banker, 2006 [4]. De typische celdichtheid gebruikt voor transfecties is 250.000 cells/6-cm gerecht. Benodigde reagentia en apparatuur zijn 50 mM kynurenic zuur, regelmatig benchtop buis houder, een benchtop koeler (best om Lipofectamine reagens koud te houden), Lipofectamine reagens, MEM, micro...

<ol>
	<li>Kulic, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubule+movement+in+bidirectional+organelle+transport.">The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).</li><li>Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+change+in+the+selective+translocation+of+the+Kinesin-1+motor+domain+marks+the+initial+specification+of+the+axon.">A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon.</a> Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).</li><li>Barkus, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Axonal+Kinesin-3+Motor+for+Fast+Anterograde+Vesicle+Transport+that+Facilitates+Retrograde+Transport+of+Neuropeptides.">Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

Live-cell imaging is een uitdagende, maar krachtige techniek voor de directe waarneming van organel transport in gekweekte neuronen. Problemen kunnen ontstaan ​​stroomopwaarts van de procedure met een slechte gezondheid neuron te wijten aan de cultuur complicaties. Daarom moeten cel gezondheid (voor voorbeelden zie ref. 4) worden beoordeeld voor en na transfectie door het observeren van de dekglaasjes terwijl in groeimedium met behulp van een weefselkweek lichtmicroscoop. Het proces van de overdracht van neuron-beva...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?ID=1144">Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons</a>. There was an error in the author's name. The author name was corrected to include a middle initial as follows:

David M. Kwinter, Michael A. Silverman

instead of:

David Kwinter, Michael Silverman.

A correction to author names has been made for article Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>Transfection reagent</td>
</tr>
<tr>
<td>10X Hanks with Ca2+ and Mg2+</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>14185-052</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>15630-130</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of dense-core vesicles in primary cultured hippocampal neurons

Observeren en karakteriseren van dynamische cellulaire processen kan belangrijke informatie opleveren over cellulaire activiteit die niet kan worden verkregen uit statische afbeeldingen. Vital fluorescerende probes, in het bijzonder groen fluorescerend eiwit (GFP) hebben een revolutie teweeggebracht in de celbiologie die voortvloeien uit de mogelijkheid om specifieke intracellulaire compartimenten en cellulaire structuren label. Zo hebben de live beeldvorming van GFP (en de spectrale varianten) hersenspinsels toegestaan ​​voor een dynamische analyse van het cytoskelet, organellen transport, en membraan dynamiek in een veelheid van organismen en celtypes [1-3]. Hoewel de live-imaging is geworden gangbaar, deze aanpak brengt nog veel technische uitdagingen, met name in de eerste gekweekte neuronen. Een uitdaging is de uitdrukking van GFP-gemerkte eiwitten in de post-mitotische neuronen, de andere is de mogelijkheid om fluorescerende beelden vast te leggen terwijl het minimaliseren van fototoxiciteit, fotobleken, en onderhouden van de algemene gezondheid van de cellen. Hier hebben we een protocol dat een lipide-gebaseerde transfectie methode die een relatief lage transfectie tarief (~ 0,5%) geeft een beschrijving, maar is ideaal voor de beeldvorming van volledig gepolariseerd neuronen. Een lage transfectie zijn essentieel, zodat een axonen en dendrieten kan worden gekenmerkt als hun oriëntatie op de cel lichaam gerichtheid van het vervoer, dat wil zeggen, anterograde v. retrograde te bevestigen. Onze benadering van beeldvorming GFP uiten van neuronen is gebaseerd op een standaard wide-field fluorescentiemicroscoop uitgerust met een CCD-camera, beeld software voor het vastleggen, en een verwarmd imaging kamer. We hebben belicht een breed scala van organellen of structuren, bijvoorbeeld, dichte-core vesicles, mitochondria, de groei kegels, en actine zonder speciale lenzen of excitatie andere eisen dan een TL-lichtbron. Bovendien kunnen spectraal-onderscheiden, fluorescent gelabelde eiwitten, bijvoorbeeld GFP en DsRed-gemerkte eiwitten, gevisualiseerd in de buurt gelijktijdig mee te vervoeren of andere gecoördineerde cellulaire gebeurtenissen karakteriseren. De imaging benadering hier beschreven is flexibel voor een verscheidenheid aan grafische toepassingen en kan worden vastgesteld door een laboratorium voor relatief weinig kosten mits een microscoop beschikbaar is.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons at JoVE.com

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Live-cell imaging is met name van nut bij het bestuderen van de dynamiek van organel mensenhandel. Hier beschrijven we een protocol voor live beeldvorming van dense-core blaasjes in gekweekte neuronen met behulp van wide-field fluorescentie microscopie. Dit protocol is flexibel en kan worden aangepast aan image andere organellen, zoals mitochondriën, endosomen, en peroxisomen.

Live-Imaging van dicht-core Blaasjes in het jeugdwerk Gekweekte hippocampale neuronen

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfectie van de hippocampus Neuronen

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

Primaire Cultuur van hippocampale neuronen van P0 pasgeboren ratten

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo&#39;s

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus-gemedieerde Genetische Verwijdering van signaalmoleculen in gekweekte primaire muis embryonale fibroblasten

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D beeldvorming van eiwitaggregatie in levende cellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organel Transport in gekweekte<em&gt; Drosophila</em&gt; Cellen: S2 cellijn en primaire neuronen.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Visualisatie van G3BP Stress Korrels Dynamics Live primaire cellen

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Live cell imaging van primaire Rat Neonatale Cardiomyocytes Na Adenovirale en Lentiviral Transduction via confocale draaiende schijf Microscopie

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...