Name: live imaging of dense-core vesicles in primary cultured hippocampal neurons
Uploaded: 2009-05-29T00:00:00
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Wir danken Harald Hutter und Helena Decker für die sorgfältige Durchsicht des Manuskripts. Wir danken auch Reg Sidhu von Leica Microsystems für seine technische Kompetenz. Diese Arbeit wurde von der National Sciences and Engineering Council of Canada, Award # 327100-06, und der Simon Fraser University Faculty of Science unterstützt.

Teil 1: Transfektion von Neuronen mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Gerätesatz-up: Ratte oder Maus Hippocampus-Neuronen sind nach Kaech und Banker, 2006 kultivierte [4]. Die typischen Zelldichte für Transfektionen verwendet beträgt 250.000 cells/6-cm Gericht. Erforderliche Reagenzien und Geräte umfassen 50 mM Kynurensäure, regelmäßige Benchtop Rohrhalter, Tisch-Kühler (am besten Lipofectamine Reagenz kalt zu halten), Lipofectamine Reagenz, MEM, Mikroz...

<ol>
	<li>Kulic, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubule+movement+in+bidirectional+organelle+transport.">The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).</li><li>Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+change+in+the+selective+translocation+of+the+Kinesin-1+motor+domain+marks+the+initial+specification+of+the+axon.">A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon.</a> Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).</li><li>Barkus, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Axonal+Kinesin-3+Motor+for+Fast+Anterograde+Vesicle+Transport+that+Facilitates+Retrograde+Transport+of+Neuropeptides.">Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

Live Cell Imaging ist eine Herausforderung, aber wirkungsvolle Technik für die direkte Beobachtung von Organellentransports in kultivierten Neuronen. Schwierigkeiten können vor-kommen des Verfahrens mit einer schlechten Neuron Gesundheit, die auf Kultur Komplikationen. Daher sollten Zelle Gesundheit (Beispiele siehe ref. 4) vor und nach der Transfektion durch die Beobachtung der Deckgläser, während in Wachstumsmedium mit einer Gewebekultur Lichtmikroskop beurteilt werden. Der Prozess der Übertragung von Neuron-halt...

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David M. Kwinter, Michael A. Silverman

instead of:

David Kwinter, Michael Silverman.

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Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>Transfection reagent</td>
</tr>
<tr>
<td>10X Hanks with Ca2+ and Mg2+</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>14185-052</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>15630-130</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of dense-core vesicles in primary cultured hippocampal neurons

Beobachtung und Charakterisierung dynamischer zellulärer Prozesse liefern wichtige Informationen über die Zellaktivität, die nicht aus statischen Bildern gewonnen werden kann. Vital fluoreszierenden Sonden, besonders grün fluoreszierende Protein (GFP) revolutioniert haben Zellbiologie, die aus der Fähigkeit, spezifische intrazelluläre Kompartimente und zelluläre Strukturen Etikett. Zum Beispiel haben die Live-Darstellung von GFP (und seine spektralen Varianten) Chimären für eine dynamische Analyse des Zytoskeletts, Organellentransports und Membran Dynamik in einer Vielzahl von Organismen und Zelltypen [1-3] erlaubt. Obwohl Live-Bildgebung hat sich verbreitet, dieser Ansatz wirft immer noch viele technische Herausforderungen, vor allem in primären kultivierten Neuronen. Eine Herausforderung ist die Expression von GFP-markierten Proteine ​​in post-mitotischen Neuronen, die andere ist die Fähigkeit, fluoreszierende Bilder zu erfassen bei gleichzeitiger Minimierung der Phototoxizität, Ausbleichen und Wartung allgemein Zelle Gesundheit. Hier bieten wir ein Protokoll, das eine Lipid-basierte Transfektion Methode, die einen relativ niedrigen Transfektionsrate (~ 0,5%) ergibt beschreibt, ist aber ideal für die Abbildung vollständig polarisierte Neuronen. Eine geringe Transfektionseffizienz ist unerlässlich, so dass einzelne Axone und Dendriten im Hinblick auf ihre Orientierung an den Zellkörper charakterisiert werden kann, um die Ausrichtung des Verkehrs, dh anterograde v. retrograde bestätigen. Unser Ansatz zur Bildgebung GFP-exprimierenden Neuronen beruht auf einem Standard-wide-field Fluoreszenzmikroskop mit einer CCD-Kamera, Bild-Capture-Software, und ein beheiztes Bildgebung Kammer ausgestattet. Wir haben eine Vielzahl von Organellen oder Strukturen abgebildet werden, zum Beispiel, dense-core Vesikel, Mitochondrien, Wachstum Kegel, und Aktin ohne besondere Optik oder Anregung andere Anforderungen als einer fluoreszierenden Lichtquelle. Darüber hinaus können spektral unterschiedlichen, fluoreszenzmarkierten Proteine, zB GFP und DsRed-markierte Proteine ​​werden in der Nähe gleichzeitig visualisiert werden, um Co-Transport-oder andere koordinierte zelluläre Ereignisse zu charakterisieren. Die Bildgebung hier beschriebene Ansatz ist flexibel für eine Vielzahl von Imaging-Anwendungen und kann durch ein Labor für die relativ geringen Kosten angenommen werden, falls ein Mikroskop zur Verfügung.

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Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Live Cell Imaging ist von besonderem Nutzen bei der Untersuchung der Dynamik von Organellen Menschenhandel. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Live-Darstellung von Dense-Core-Vesikel in kultivierten Neuronen mit Weitwinkel-Fluoreszenzmikroskopie. Dieses Protokoll ist flexibel und kann an image anderen Organellen wie Mitochondrien angepasst werden, Endosomen und Peroxisomen.

Live-Imaging von Dense-Core-Vesikel in Primary hippokampalen Neuronen

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfektion von Neuronen im Hippocampus

Forschung

Biologie

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

Primäre Kultur des Hippocampus-Neuronen von neugeborenen Ratten P0

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus-vermittelte genetische Entfernung von Signalmolekülen in kultivierten primären embryonalen Maus-Fibroblasten

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organell-Transport in kultivierten<em&gt; Drosophila</em&gt; Zellen: S2-Zelllinie und primären Neuronen.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Visualisierung von G3BP Stress-Granulat Dynamics Live Primärzellen

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Live Cell Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten Neonatal Nach Adenovirale und Lentivirale Transduktion mittels konfokaler Mikroskopie Spinning-Disk-

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...