Name: live imaging of dense-core vesicles in primary cultured hippocampal neurons
Uploaded: 2009-05-29T00:00:00
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Ringraziamo Harald Hutter e Helena Decker per la loro attenta lettura di questo manoscritto. Ringraziamo anche Reg. Sidhu di Leica Microsystems per la sua competenza tecnica. Questa ricerca è stata sostenuta dalla Scienze e Ingegneria del Consiglio Nazionale del Canada, Premio # 327100-06, e la Simon Fraser Facoltà Universitaria di Scienze.

Parte 1: Transfection dei neuroni utilizzando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Attrezzature di set-up: Neuroni dell&#39;ippocampo di ratto o il mouse sono coltivate secondo Kaech e banchiere, 2006 [4]. La densità tipica cellula usata per trasfezioni è di 250.000 piatto cells/6-cm. Reagenti necessari e le attrezzature includono 50 acido kynurenic mM, regolare titolare tubo da banco, un dispositivo di raffreddamento da banco (meglio per mantenere freddo Lipofectamine r...

<ol>
	<li>Kulic, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubule+movement+in+bidirectional+organelle+transport.">The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).</li><li>Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+change+in+the+selective+translocation+of+the+Kinesin-1+motor+domain+marks+the+initial+specification+of+the+axon.">A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon.</a> Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).</li><li>Barkus, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Axonal+Kinesin-3+Motor+for+Fast+Anterograde+Vesicle+Transport+that+Facilitates+Retrograde+Transport+of+Neuropeptides.">Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

L&#39;imaging cellulare dal vivo è una tecnica difficile, ma potente per l&#39;osservazione diretta del trasporto degli organelli nei neuroni in coltura. Le difficoltà possono sorgere a monte della procedura con la salute dei neuroni poveri a causa di complicazioni cultura. Di conseguenza, la salute delle cellule (per esempi vedi rif. 4) deve essere valutata prima e dopo la trasfezione osservando i coprioggetti mentre nel mezzo di crescita mediante una cultura microscopio dei tessuti leggeri. Il processo di trasferime...

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David M. Kwinter, Michael A. Silverman

instead of:

David Kwinter, Michael Silverman.

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Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>Transfection reagent</td>
</tr>
<tr>
<td>10X Hanks with Ca2+ and Mg2+</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>14185-052</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>15630-130</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of dense-core vesicles in primary cultured hippocampal neurons

L&#39;osservazione e la caratterizzazione dinamica dei processi cellulari può fornire informazioni importanti sulle attività cellulare che non possono essere acquisite immagini statiche. Vital sonde fluorescenti, in particolare proteina fluorescente verde (GFP) hanno rivoluzionato la biologia delle cellule che derivano dalla capacità di etichetta specifici comparti intracellulari e strutture cellulari. Per esempio, l&#39;immagine dal vivo di GFP (e le sue varianti spettrale) chimere hanno permesso un&#39;analisi dinamica del citoscheletro, il trasporto degli organelli, e le dinamiche della membrana in una moltitudine di organismi e di tipi di cellule [1-3]. Sebbene l&#39;imaging dal vivo è diventata prevalente, questo approccio pone ancora molti problemi tecnici, in particolare nella scuola primaria neuroni coltivati. Una sfida è l&#39;espressione di proteine ​​GFP-tagged in post-mitotico neuroni, l&#39;altro è la capacità di catturare immagini a fluorescenza, riducendo al minimo fototossicità, photobleaching, e mantenere la salute generale delle cellule. Qui forniamo un protocollo che descrive un metodo a base di lipidi transfezione che produce un tasso di trasfezione relativamente basso (~ 0,5%), è tuttavia ideale per l&#39;imaging di neuroni completamente polarizzata. Un tasso di trasfezione basso è essenziale in modo che gli assoni e dendriti singolo può essere caratterizzato da loro orientamento verso il corpo cellulare per confermare la direzionalità di trasporto, cioè, anterograda v. retrograda. Il nostro approccio all&#39;imaging GFP che esprimono i neuroni si basa su uno standard a grande campo microscopio a fluorescenza equipaggiato con una telecamera CCD, software per la cattura delle immagini, e una camera di imaging riscaldata. Abbiamo immaginato una grande varietà di organelli o strutture, ad esempio, densi-core vescicole, mitocondri, coni di crescita, e actina senza ottica o esigenze particolari di eccitazione che non sia un fonte di luce fluorescente. Inoltre, spettralmente-distinte, proteine ​​fluorescente, ad esempio, GFP-tagged DsRed e proteine, possono essere visualizzati simultaneamente vicino a caratterizzare co-trasporto o altri eventi coordinati cellulare. L&#39;approccio di imaging qui descritto è flessibile per una varietà di applicazioni di imaging e può essere adottata da un laboratorio per il costo relativamente poco fornito un microscopio è disponibile.

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Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

L&#39;imaging cellulare Live è di particolare utilità quando si studiano le dinamiche del traffico di organelli. Qui si descrive un protocollo per l&#39;imaging dal vivo di denso-core vescicole in neuroni coltivati ​​con grande campo microscopia a fluorescenza. Questo protocollo è flessibile e può essere adattato a organelli altra immagine come i mitocondri, endosomi e perossisomi.

Immagini dal vivo di Dense-core Vescicole nella Primaria neuroni coltivati ​​ippocampale

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun trasfezione di neuroni dell&#39;ippocampo

Ricerca

Biologia

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

Cultura primaria di neuroni dell&#39;ippocampo da P0 ratti neonati

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus-mediata rimozione genetica di molecole di segnalazione in fibroblasti di topo coltivate primarie embrionali

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D Imaging di aggregazione proteica in cellule vive

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Trasporti in Colta<em&gt; Drosophila</em&gt; Celle: Cell Line S2 e Primaria neuroni.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Visualizzazione dei G3BP stress Granuli Dynamics in cellule primarie in diretta

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Imaging cellulare dal vivo di primaria ratto neonato Cardiomyocytes seguito Adenoviral e lentivirali trasduzione Uso confocale Spinning Disk Microscopia

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Immagini dal vivo di Dense-core Vescicole nella Primaria neuroni coltivati ​​ippocampale

Immagini dal vivo di Dense-core Vescicole nella Primaria neuroni coltivati ippocampale