Name: live imaging of dense-core vesicles in primary cultured hippocampal neurons
Uploaded: 2009-05-29T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons at JoVE.com

Agradecemos a Harald Hutter e Helena Decker para a sua leitura cuidadosa deste manuscrito. Agradecemos também Reg Sidhu da Leica Microsystems por sua perícia técnica. Esta pesquisa foi apoiada pelo Conselho Nacional e Ciências de Engenharia do Canadá, Prêmio # 327100-06, eo Simon Fraser University Faculty of Science.

Parte 1: Transfecção de neurônios utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Equipamentos de set-up: Rato ou camundongo neurônios do hipocampo são cultivadas de acordo com Kaech e Banker, 2006 [4]. A densidade celular mais utilizados para a transfections é de 250.000 prato cells/6-cm. Reagentes e equipamentos necessários incluem 50 mM de ácido cinurênico, suporte para tubos regulares de bancada, um refrigerador de bancada (o melhor para manter frio reagente L...

<ol>
	<li>Kulic, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubule+movement+in+bidirectional+organelle+transport.">The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).</li><li>Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+change+in+the+selective+translocation+of+the+Kinesin-1+motor+domain+marks+the+initial+specification+of+the+axon.">A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon.</a> Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).</li><li>Barkus, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Axonal+Kinesin-3+Motor+for+Fast+Anterograde+Vesicle+Transport+that+Facilitates+Retrograde+Transport+of+Neuropeptides.">Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

Imagens de células vivas é uma técnica difícil, mas poderosa para a observação direta de organela transporte em neurônios cultivados. Podem surgir dificuldades com a montante do procedimento com pobre saúde neurônio devido a complicações cultura. Portanto, a saúde da célula (para exemplos, ver ref. 4) devem ser avaliadas antes e após a transfecção, observando as lamelas, enquanto em meio de crescimento usando um tecido microscópio de luz cultura. O processo de transferência dos neurônios contendo lam?...

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David M. Kwinter, Michael A. Silverman

instead of:

David Kwinter, Michael Silverman.

A correction to author names has been made for article Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>Transfection reagent</td>
</tr>
<tr>
<td>10X Hanks with Ca2+ and Mg2+</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>14185-052</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>15630-130</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of dense-core vesicles in primary cultured hippocampal neurons

Observação e caracterização dinâmica processos celulares podem fornecer informações importantes sobre a atividade celular que não pode ser adquirida a partir de imagens estáticas. Vital sondas fluorescentes, particularmente proteína fluorescente verde (GFP) revolucionaram a biologia celular decorrentes da capacidade de rótulo específico compartimentos intracelular e estruturas celulares. Por exemplo, a imagem ao vivo da GFP (e suas variantes espectral) quimeras têm permitido uma análise dinâmica do citoesqueleto, transporte organela, ea dinâmica da membrana em uma infinidade de organismos e tipos celulares [1-3]. Apesar de imagens ao vivo tornou-se predominante, essa abordagem ainda apresenta muitos desafios técnicos, particularmente no ensino primário neurônios cultivados. Um desafio é a expressão de proteínas GFP na pós-mitóticas neurônios, o outro é a capacidade de capturar imagens fluorescentes, minimizando fototoxicidade, fotodegradação, e manter a saúde das células em geral. Aqui nós fornecemos um protocolo que descreve um método de transfecção lipídica baseado em que produz uma taxa de transfecção relativamente baixo (~ 0,5%), porém, é ideal para a imagem de neurônios totalmente polarizada. A taxa de transfecção baixo é essencial para que os axônios e dendritos só pode ser caracterizada como a sua orientação para o corpo celular para confirmar a direcionalidade de transporte, ou seja, v. anterógrada retrógrada. A nossa abordagem à imagem GFP expressar neurônios depende de um microscópio de campo amplo fluorescente padrão equipado com uma câmera CCD, software de captura de imagem, e uma câmara de imagem aquecida. Temos imaged uma grande variedade de organelas ou estruturas, por exemplo, com núcleo denso vesículas, mitocôndrias cones, crescimento e actina, sem qualquer ótica ou requisitos especiais de excitação que não seja uma fonte de luz fluorescente. Além disso, espectralmente distintas, as proteínas etiquetadas fluorescente, por exemplo, GFP e dsRed marcadas proteínas, podem ser visualizados simultaneamente perto de caracterizar co-transporte ou outros eventos coordenados celular. A abordagem de imagem aqui descrito é flexível para uma variedade de aplicações de imagem e pode ser adotado por um laboratório de custo relativamente pouco desde um microscópio está disponível.

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Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Imagens de células vivas é de utilidade particular quando se estuda a dinâmica do tráfico organela. Aqui nós descrevemos um protocolo para geração de imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso em neurônios cultivados com grande campo de microscopia de fluorescência. Este protocolo é flexível e pode ser adaptado para outras organelas imagem, tais como mitocôndrias, endossomos, e peroxissomos.

Imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso na Primária Cultivadas neurônios do hipocampo

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfection de neurônios do hipocampo

Biologia

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

Cultura primária de neurônios do hipocampo de ratos recém-nascidos P0

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovírus mediada por remoção genética das moléculas de sinalização em fibroblastos de rato cultivadas Primária embrionárias

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Formação de imagens 4D de agregação de proteínas em células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Transporte Organelle em Cultivadas<em&gt; Drosophila</em&gt; Células: Linha celular S2 e primário neurônios.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Visualização de G3BP Estresse grânulos Dynamics em pilhas ao vivo

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Imagens de células vivas de primários de ratos neonatos Cardiomyocytes Após Adenoviral e Transdução Lentivirus Usando confocal Spinning Disk Microscopia

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...