Name: live imaging of dense-core vesicles in primary cultured hippocampal neurons
Uploaded: 2009-05-29T00:00:00
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Damos las gracias a Harald Hutter y Decker Helena por su cuidadosa lectura de este manuscrito. También agradecemos a Reg Sidhu de Leica Microsystems por su experiencia técnica. Esta investigación fue apoyada por el Nacional de Ciencias e Ingeniería del Consejo de Canadá, el Premio # 327100-06, y de la Simon Fraser Facultad Universitaria de Ciencias.

Parte 1: La transfección de las neuronas con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Instalación del equipo: Las neuronas del hipocampo de rata o ratón se cultivaron de acuerdo con Kaech y Banker, 2006 [4]. La densidad celular típico utilizado para transfecciones es de 250.000 cells/6-cm plato. Reactivos y equipos necesarios son 50 mM de ácido quinurénico, titular regular de tubo de laboratorio, un enfriador de sobremesa (el mejor para mantener fríos los reactivos Lipo...

<ol>
	<li>Kulic, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubule+movement+in+bidirectional+organelle+transport.">The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).</li><li>Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+change+in+the+selective+translocation+of+the+Kinesin-1+motor+domain+marks+the+initial+specification+of+the+axon.">A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon.</a> Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).</li><li>Barkus, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Axonal+Kinesin-3+Motor+for+Fast+Anterograde+Vesicle+Transport+that+Facilitates+Retrograde+Transport+of+Neuropeptides.">Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

Imágenes de células vivas es una técnica difícil, pero de gran alcance para la observación directa de transporte de orgánulos en las neuronas cultivadas. Pueden surgir dificultades aguas arriba del procedimiento con la salud neuronal pobres debido a las complicaciones cultura. Por lo tanto, la salud celular (para ejemplos, ver ref. 4) deben ser evaluados antes y después de la transfección mediante la observación de los cubreobjetos, mientras que en medio de crecimiento con un cultivo de tejidos microscopio de l...

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David M. Kwinter, Michael A. Silverman

instead of:

David Kwinter, Michael Silverman.

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Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>Transfection reagent</td>
</tr>
<tr>
<td>10X Hanks with Ca2+ and Mg2+</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>14185-052</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>15630-130</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of dense-core vesicles in primary cultured hippocampal neurons

La observación y la caracterización dinámica de los procesos celulares pueden dar información importante sobre la actividad celular que no se puede obtener a partir de imágenes estáticas. Vital sondas fluorescentes, especialmente proteína fluorescente verde (GFP) ha revolucionado la biología celular derivada de la capacidad de etiqueta específica compartimentos intracelulares y las estructuras celulares. Por ejemplo, la imagen en vivo de las buenas prácticas agrarias (y sus variantes espectral) quimeras han permitido un análisis dinámico del citoesqueleto, orgánulos de transporte, y la dinámica de la membrana en una multitud de organismos y tipos de células [1-3]. A pesar de imagen en vivo se ha convertido en frecuente, este enfoque también plantea muchos problemas técnicos, sobre todo en primaria neuronas cultivadas. Uno de ellos es la expresión de las buenas prácticas agrarias de etiquetado proteínas en las neuronas post-mitóticas, y el otro es la capacidad de capturar imágenes fluorescentes y reducir al mínimo la fototoxicidad, photobleaching, y mantener la salud celular en general. Aquí les ofrecemos un protocolo que describe un método de transfección basado en lípidos que produce una tasa de transfección relativamente baja (~ 0,5%), sin embargo, es ideal para la proyección de imagen de las neuronas totalmente polarizada. Una baja tasa de transfección es esencial para que los axones y las dendritas solo puede ser caracterizado en cuanto a su orientación hacia el cuerpo celular para confirmar la direccionalidad del transporte, es decir, anterógrada v. retrógrada. Nuestro enfoque de la imagen de las neuronas que expresan GFP se basa en un estándar de campo amplio microscopio de fluorescencia equipado con una cámara CCD, software de captura de imágenes, y una cámara de imágenes calientes. Hemos fotografiado una amplia variedad de organelos o estructuras, por ejemplo, denso núcleo de las vesículas, los conos de la mitocondria, el crecimiento y la actina sin ningún tipo de óptica o requisitos especiales de excitación que no sea una fuente de luz fluorescente. Además, espectralmente diferentes, las proteínas de la etiqueta fluorescente, por ejemplo, las buenas prácticas agrarias y de las proteínas dsRed con etiquetas, se puede visualizar al mismo tiempo cerca de caracterizar el transporte co-u otros eventos celulares coordinada. El enfoque de imagen se describe aquí es flexible para una variedad de aplicaciones de imagen y pueden ser adoptadas por un laboratorio de un costo relativamente bajo un microscopio siempre está disponible.

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Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Imágenes de células vivas es de particular utilidad en el estudio de la dinámica del tráfico de orgánulos. A continuación se describe un protocolo para obtener imágenes en vivo de alta densidad de núcleo vesículas en las neuronas cultivadas con amplio campo de la microscopía de fluorescencia. Este protocolo es flexible y puede adaptarse a los orgánulos de imagen como las mitocondrias, endosomas, y peroxisomas.

Imágenes en vivo del denso núcleo de vesículas en la Primaria neuronas del hipocampo cultivadas

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfección de las neuronas del hipocampo

Investigación

Biología

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

Cultivo primario de neuronas del hipocampo de ratas recién nacidas P0

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Mediada por adenovirus eliminación de moléculas de señalización genética en cultivos de fibroblastos de embriones de ratón primaria

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D de imágenes de la agregación de proteínas en células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Orgánulos Transporte en Cultivadas<em&gt; Drosophila</em&gt; Celdas: S2 Línea Celular y neuronas primarias.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Visualización de G3BP estrés gránulos Dinámica en Pilas en directo

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Imágenes de células vivas de primarias de rata neonatal cardiomiocitos Siguiendo Adenoviral y lentiviral transducción Usando Confocal Spinning disco Microscopía

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...