Name: live imaging of dense-core vesicles in primary cultured hippocampal neurons
Uploaded: 2009-05-29T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons at JoVE.com

Vi tackar Harald Hutter och Helena Decker för noggrann läsning av detta manuskript. Vi tackar också Reg Sidhu från Leica Microsystems för hans tekniska kunnande. Denna forskning stöds av National Sciences and Engineering Council of Canada, Award # 327.100-06 och Simon Fraser University Faculty of Science.

Del 1: transfektion av nervceller med hjälp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Utrustning set-up: Råtta eller mus hippocampus nervceller odlas enligt Kaech och Bankiren, 2006 [4]. Den typiska celltäthet används för transfections är 250 tusen cells/6-cm maträtt. Nödvändiga reagens och utrustning inkluderar 50 mM kynurensyra, vanlig bänk rörhållare, en bänk kylare (bäst att hålla Lipofectamine reagens kallt), Lipofectamine reagens, MEM, mikrofugrö...

<ol>
	<li>Kulic, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubule+movement+in+bidirectional+organelle+transport.">The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).</li><li>Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+change+in+the+selective+translocation+of+the+Kinesin-1+motor+domain+marks+the+initial+specification+of+the+axon.">A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon.</a> Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).</li><li>Barkus, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Axonal+Kinesin-3+Motor+for+Fast+Anterograde+Vesicle+Transport+that+Facilitates+Retrograde+Transport+of+Neuropeptides.">Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

Levande cell imaging är en utmanande, men kraftfull teknik för direkt observation av organell transporter i odlade nervceller. Svårigheter kan uppstå före förfarandet med dålig neuron hälsa på grund av kultur komplikationer. Därför bör cell hälsa (för exempel se ref. 4) bedömas före och efter transfektion genom att observera täckglasen medan tillväxten mediet med hjälp av en vävnad mikroskop kultur ljus. Processen att överföra neuron innehåller täckglasen till avbildning kammaren kan vara stressi...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?ID=1144">Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons</a>. There was an error in the author's name. The author name was corrected to include a middle initial as follows:

David M. Kwinter, Michael A. Silverman

instead of:

David Kwinter, Michael Silverman.

A correction to author names has been made for article Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>Transfection reagent</td>
</tr>
<tr>
<td>10X Hanks with Ca2+ and Mg2+</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>14185-052</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>15630-130</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of dense-core vesicles in primary cultured hippocampal neurons

Observera och karakterisera dynamiska cellulära processer kan ge viktig information om cellulär aktivitet som inte kan dras av statiska bilder. Vital fluorescerande prober, särskilt grönt fluorescerande protein (GFP) har revolutionerat cellbiologi härrör från förmågan att märka specifika intracellulära fack och cellstrukturer. Till exempel har den levande avbildning av GFP (och dess spektrala varianter) chimärer tillåtet för en dynamisk analys av cytoskelettet, organell transport och dynamik membran i en mängd organismer och celltyper [1-3]. Även Bildproduktion har blivit vanligare, innebär detta synsätt fortfarande många tekniska utmaningar, särskilt i grundskolor odlade nervceller. En utmaning är ett uttryck för GFP-märkta proteiner i post-mitotiska nervceller, den andra är förmågan att fånga fluorescerande bilder samtidigt minimera fototoxicitet, fotoblekning och upprätthålla allmän cell hälsa. Här ger vi ett protokoll som beskriver en lipid-baserat transfektion metod som ger en relativt låg transfektion skattesats (~ 0,5%), men är idealisk för att avbilda fullständigt polariserade nervceller. En låg transfektion är nödvändigt med så att enda axoner och dendriter kan karakteriseras som till sin läggning till cellkroppen att bekräfta riktning av transport, dvs anterograd v. retrograd. Vår syn på bildbehandling GFP uttrycka nervceller bygger på en standard brett fält fluorescerande mikroskop utrustad med en CCD-kamera, bildbehandlingsprogrammet, och en uppvärmd avbildning kammare. Vi har avbildat ett brett utbud av organeller eller strukturer, till exempel tät-core blåsor, mitokondrier, koner tillväxt och aktin utan några särskilda optiken eller krav excitation annat än en fluorescerande ljuskälla. Dessutom kan spektralt-distinkt, fluorescerande proteiner, till exempel, GFP och dsRed-märkta proteiner, visualiseras i närheten samtidigt för att karakterisera samarbete transport eller andra samordnade cellulära händelser. Den avbildningsteknik som beskrivs här är flexibel för olika bildprogram och kan antas av ett laboratorium för relativt liten kostnad som ett mikroskop är tillgänglig.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons at JoVE.com

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Levande cell imaging är av särskild nytta när man studerar dynamiken i organell människohandel. Här beskriver vi ett protokoll för live avbildning av tät-core blåsor i odlade nervceller med hjälp av brett fält fluorescensmikroskopi. Detta protokoll är flexibel och kan anpassas för att bilden andra organeller som mitokondrier, endosomes och peroxisomer.

Bildproduktion av tät-core Blåsor i Primär Odlade hippocampus nervceller

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun transfektion av hippocampus nervceller

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

Primär Kultur av hippocampus nervceller från P0 nyfödda råttor

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Bildproduktion för cell motilitet och Actin cytoskelettet av enskilda nervceller och neurala celler Crest i Zebrafish embryon

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus-medierad genetisk Borttagning av signalmolekyler i odlade primära musknappen Embryonala fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-baserad Mätning av Store-drivs kalcium Entry i levande celler: från odlade Cancer Cell till skelettmuskulatur Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D avbildning av proteinaggregering i levande celler

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organell Transport i Odlade<em&gt; Drosophila</em&gt; Celler: S2 cellinje och primär nervceller.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Visualisering av G3BP Stress Granulat Dynamics i Live Primärceller

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Levande cell imaging av Primär Rat Neonatal Cardiomyocytes Efter Adenoviral och Lentiviral Transduction Använda Konfokal Spinning Disk mikroskopi

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...