Name: visualizing antigen specific cd4+ t cells using mhc class ii tetramers
Uploaded: 2009-03-06T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers at JoVE.com

<p class="jove_content"> Nous remercions Dick Foley et Leigh Kimball pour leur rôle clé dans le tournage et la production vidéo. </p>

<p class="jove_title"> 1. Sang périphérique de cellules mononucléaires (PBMC) isolement </p><ol><li> Obtenir un échantillon de sang - le sang doit être recueilli dans des seringues ou des tubes de sang et d&#39;anti-coagulant par l&#39;héparine (1:50 ratio) pour empêcher la coagulation. Attendez-vous à un rendement d&#39;environ 1 × 10 <sup>6</sup> PBMC par ml de sang - environ 40% de ce qui sera CD4 positifs (CD4 +) des cellules T. </li><li> Aliquoter le sang dans 50 ml tubes coniques, 25 ml par tube. Si le sang a séparé, mélanger ...

<ol>
	<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4++T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen.">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> <em style='font-style: italic'>J. Clin. Invest</em>. <b>104</b>, R63-R67 (1999).</li><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetramer-guided+epitope+mapping:+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4++T+cell+epitopes+from+complex+antigens.">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> <em style='font-style: italic'>J. Immunol</em>. <b>166</b>, 6665-6670 (2001).</li></ol>

<p class="jove_content"> Comprendre le rôle des cellules T CD4 + dans l&#39;immunité est fondamentalement important. Toutefois, CD4 + spécifiques de l&#39;antigène des cellules T peut être difficile à détecter et d&#39;isoler à l&#39;aide des méthodes traditionnelles. En revanche, CMH de classe II tétramères permettent la visualisation directe des cellules T CD4 + à la spécificité de l&#39;antigène désiré. Cette vidéo montre l&#39;isolement, la purification et l&#39;amplification in vitro des cellules T CD4 + et leur visualisa...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Class 2 Laminar flow biosafety cabinet</td>
<td>equipment</td>
<td>Thermo Forma</td>
<td>1200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>50 mL conical Tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>47747-182</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>1X PBS (Ca/Mg free)</td>
<td>Reagent</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30028.02</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Ficoll-paque PLUS</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1440-03</td>
<td>foil wrapped to protect from light</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipet Aid XP</td>
<td>equipment</td>
<td>Drummond</td>
<td>4-000-101</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>10 mL pipet</td>
<td>equipment</td>
<td>Corning/Costar</td>
<td>CLS4492</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Aerosolve Canisters</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>359481</td>
<td>with 50 mL inserts</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>GS-6R</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipets </td>
<td>equipment</td>
<td>Samco</td>
<td>202-20S</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipets</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>14672-200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemolytic Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T6146</td>
<td>0.2% in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemocytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR </td>
<td>15170-208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL conical tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>05-527-90</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Running Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-155</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>EasySep&reg;   Magnet</td>
<td>equipment</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>18000</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL polypropylene tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352063</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Reagent</td>
<td> Invitrogen</td>
<td>22400-089</td>
<td>with 25 mM HEPES</td>
</tr>
<tr>
<td>Pooled human serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>1570-063</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>500mL 0.22 micron bottle top filter</td>
<td>equipment</td>
<td>Nalgene</td>
<td>595-3320</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>48-well plate</td>
<td>equipment</td>
<td>Costar</td>
<td>3548</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>37&deg;C CO<sub>2</sub> incubator</td>
<td>equipment</td>
<td>Sanyo Scientific</td>
<td>MCO-18AIC</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL synthetic peptide</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Custom synthesis from any peptide vendor</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL FACS tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352008</td>
<td>Polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Peptide loaded class II tetramer (as described)</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Prepared by the BRI tetramer core</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD3</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD pharmingen</td>
<td>347344</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD4</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>17-0049-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD25</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>11-0259-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Facs Calibur Flow Cytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>342975</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

visualizing antigen specific cd4+ t cells using mhc class ii tetramers

<p class="jove_content">Complexe majeur d&#39;histocompatibilité (CMH) de classe II tétramères permettent la visualisation directe des cellules CD4 + spécifiques de l&#39;antigène des cellules T par cytométrie en flux. Cette méthode repose sur l&#39;interaction entre le peptide hautement spécifique chargée du CMH et les correspondants récepteur des cellules T. Alors que l&#39;affinité d&#39;un seul CMH / peptide molécule est faible, la réticulation des complexes CMH / peptide avec la streptavidine augmente l&#39;avidité de l&#39;interaction, permettant leur utilisation comme réactifs coloration. En raison de la fréquence relativement faible des lymphocytes T CD4 + (~ 1 300 000 en une seule spécificité) ce test utilise une étape de l&#39;amplification in vitro d&#39;augmenter son seuil de détection. Des cellules mononucléaires sont purifiés à partir du sang périphérique par la sous-couche de Ficoll. Cellules CD4 + sont ensuite séparés par une sélection négative utilisant un cocktail d&#39;anticorps biotinylé et d&#39;anti-biotine billes magnétiques. En utilisant des cellules adhérentes de la fraction de cellules CD4 que cellules présentatrices d&#39;antigènes, cellules T CD4 + sont développées dans les médias par l&#39;ajout d&#39;un peptide antigénique et de l&#39;IL-2. Les cellules sont colorées avec élargi correspondant de classe II tétramère en incubant à 37 ° C pendant une heure et ensuite colorées à l&#39;aide d&#39;anticorps de surface tels que l&#39;anti-CD4, anti-CD3 et anti-CD25. Après marquage, les cellules peuvent être directement analysées par cytométrie en flux. Les cellules positives tétramère se forment généralement une population distincte parmi les CD4 + cellules élargi. Cellules tétramère positifs sont généralement CD25 + CD4 et souvent élevé. Parce que le niveau de coloration tétramère de fond peut varier, les résultats coloration positive doit toujours être comparée à la coloration des cellules mêmes avec un tétramère pertinent. Multiples variantes de ce test de base sont possibles. Cellules tétramère positifs peuvent être triées pour l&#39;analyse phénotypique d&#39;autres, l&#39;inclusion dans ELISPOT ou de tests de prolifération, ou d&#39;autres épreuves du secondaire. Plusieurs groupes ont également démontré la co-marquage utilisant des tétramères et soit anti-cytokine et anti-FoxP3 anticorps.</p>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers at JoVE.com

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

<p class="jove_content">Cette procédure montre la purification et l&#39;expansion in vitro des cellules CD4 + spécifiques de l&#39;antigène des cellules T du sang périphérique entier et leur visualisation en utilisant des tétramères CMH de classe II. Tétramères permettent la visualisation directe des cellules T avec une spécificité antigénique unique et défini CMH de classe II restriction.</p>

Antigène spécifique de CD4 + Visualisation cellules T à l&#39;aide du CMH de classe II tétramères

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Research

JoVE Journal

Biology

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

T CD4 + des lymphocytes capturer en utilisant une puce jetable microfluidiques pour le VIH

Recherche

Biologie

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolement des cellules T CD4 + des ganglions lymphatiques de souris en utilisant Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells <em>In situ</em>

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Une technique pour visualiser simultanément spécifiques du virus de cellules CD8 + T et les cellules infectées<em> In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

L&#39;isolement des cellules endothéliales valvulaires

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Cell Specific Analysis of <em>Arabidopsis</em> Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Analyse cellulaire spécifique de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Feuilles en utilisant la fluorescence par tri cellulaire activé

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Visualisation des bactéries dans nématodes en utilisant la microscopie à fluorescence

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Un essai de liaison à haut débit CMH II pour l&#39;analyse quantitative du peptide épitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Détection de intracellulaire Gene Expression dans des cellules vivantes de murin, humain et porcin Origine utilisant des nanoparticules marquées par fluorescence

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in <em>C. elegans</em> Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Suivi et quantification des processus de développement des<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilisation des outils open-source

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Isolation of CD4<sup>+</sup> T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Isolement des CD4<sup>+</sup> T-cellules et analyse de circulation folliculaire T Helper (cTfh) des sous-ensembles de cellules de sang périphérique à l’aide 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...