Name: visualizing antigen specific cd4+ t cells using mhc class ii tetramers
Uploaded: 2009-03-06T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers at JoVE.com

<p class="jove_content"> Wir danken Dick Foley und Leigh Kimball für ihre Schlüsselrolle bei der Film-und Videoproduktion. </p>

<p class="jove_title"> 1. Periphere mononukleäre Zellen (PBMC) isoliert </p><ol><li> Besorgen Sie sich eine Blutprobe - Blut sollte in Spritzen oder Blut-Röhrchen gesammelt und anti-koaguliert mit Heparin (1:50 ratio) Gerinnen zu verhindern. Erwarten Sie eine Ausbeute von etwa 1 × 10 <sup>6</sup> PBMC pro ml Blut - etwa 40% davon werden CD4 positive (CD4 +) T-Zellen sein. </li><li> Aliquot dem Blut in 50 ml konische Röhrchen, 25 ml pro Röhrchen. Wenn Blut getrennt hat, sanft vor Aliquotierung Mix, um das Plasma zu verteilen </li><li> Add P...

<ol>
	<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4++T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen.">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> <em style='font-style: italic'>J. Clin. Invest</em>. <b>104</b>, R63-R67 (1999).</li><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetramer-guided+epitope+mapping:+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4++T+cell+epitopes+from+complex+antigens.">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> <em style='font-style: italic'>J. Immunol</em>. <b>166</b>, 6665-6670 (2001).</li></ol>

<p class="jove_content"> Verständnis der Rolle der CD4 + T-Zellen im Immunsystem ist von grundlegender Bedeutung. Allerdings können Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen schwer zu erkennen und zu isolieren, die mit traditionellen Methoden. Im Gegensatz dazu erlauben MHC-Klasse-II-Tetramere die direkte Visualisierung von CD4 + T-Zellen mit der gewünschten Antigen-Spezifität. Dieses Video zeigt die Isolierung, Reinigung und In-vitro-Amplifikation von CD4 + T-Zellen und deren anschließende Visualisierung mit Tetrameren. Klasse II Tetramere sind...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Class 2 Laminar flow biosafety cabinet</td>
<td>equipment</td>
<td>Thermo Forma</td>
<td>1200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>50 mL conical Tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>47747-182</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>1X PBS (Ca/Mg free)</td>
<td>Reagent</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30028.02</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Ficoll-paque PLUS</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1440-03</td>
<td>foil wrapped to protect from light</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipet Aid XP</td>
<td>equipment</td>
<td>Drummond</td>
<td>4-000-101</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>10 mL pipet</td>
<td>equipment</td>
<td>Corning/Costar</td>
<td>CLS4492</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Aerosolve Canisters</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>359481</td>
<td>with 50 mL inserts</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>GS-6R</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipets </td>
<td>equipment</td>
<td>Samco</td>
<td>202-20S</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipets</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>14672-200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemolytic Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T6146</td>
<td>0.2% in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemocytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR </td>
<td>15170-208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL conical tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>05-527-90</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Running Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-155</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>EasySep&reg;   Magnet</td>
<td>equipment</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>18000</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL polypropylene tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352063</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Reagent</td>
<td> Invitrogen</td>
<td>22400-089</td>
<td>with 25 mM HEPES</td>
</tr>
<tr>
<td>Pooled human serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>1570-063</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>500mL 0.22 micron bottle top filter</td>
<td>equipment</td>
<td>Nalgene</td>
<td>595-3320</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>48-well plate</td>
<td>equipment</td>
<td>Costar</td>
<td>3548</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>37&deg;C CO<sub>2</sub> incubator</td>
<td>equipment</td>
<td>Sanyo Scientific</td>
<td>MCO-18AIC</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL synthetic peptide</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Custom synthesis from any peptide vendor</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL FACS tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352008</td>
<td>Polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Peptide loaded class II tetramer (as described)</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Prepared by the BRI tetramer core</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD3</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD pharmingen</td>
<td>347344</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD4</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>17-0049-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD25</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>11-0259-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Facs Calibur Flow Cytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>342975</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

visualizing antigen specific cd4+ t cells using mhc class ii tetramers

<p class="jove_content">Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II Tetramere erlauben die direkte Visualisierung von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode basiert auf der hoch spezifische Wechselwirkung zwischen Peptid beladenen MHC und die entsprechenden T-Zell-Rezeptor. Während die Affinität eines einzelnen MHC / Peptid-Molekül ist gering, Vernetzung MHC / Peptid-Komplexe mit Streptavidin erhöht die Avidität der Interaktion, so dass ihre Verwendung als Färbereagenzien. Wegen der relativ niedrigen Frequenzen von CD4 + T-Zellen (~ 1 in 300.000 für einen einzigen Spezifität) diesen Test nutzt eine in vitro-Amplifikation Schritt zu seiner Schwelle Erkennung zu erhöhen. Mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut durch Ficoll Unterlage gereinigt. CD4 + Zellen werden dann durch negative Selektion mittels biotinylierten Antikörper-Cocktail und anti-Biotin markiert magnetische Kügelchen getrennt. Mit adhärenten Zellen aus der CD4-Zell-Fraktion als Antigen-präsentierende Zellen, CD4 + T-Zellen werden in Medien, indem eine antigene Peptid-und IL-2 erweitert. Die expandierten Zellen sind mit der entsprechenden Klasse II Tetramer durch Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde und anschließend gefärbt mit Oberfläche Antikörper wie anti-CD4, anti-CD3 und anti-CD25 gefärbt. Nach der Etikettierung können die Zellen direkt mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Das Tetramer-positiven Zellen bilden typischerweise eine deutliche Bevölkerung unter den erweiterten CD4 +-Zellen. Tetramer-positiven Zellen sind in der Regel CD25 + CD4 und oft hoch. Da der Pegel der Hintergrundgeräusche Tetramer-Färbung kann variieren, sollten positive Färbung Ergebnisse immer auf die Färbung von den gleichen Zellen mit einem irrelevanten Tetramer verglichen werden. Mehrere Variationen dieses grundlegende Assay sind möglich. Tetramer-positive Zellen können für weitere phänotypische Analyse, Aufnahme in ELISPOT oder Proliferation Assays oder andere sekundäre Assays sortiert werden. Mehrere Gruppen haben auch Co-Färbung mit Tetrameren und entweder Anti-Zytokin-oder Anti-FoxP3 Antikörper nachgewiesen.</p>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers at JoVE.com

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

<p class="jove_content">Dieses Verfahren zeigt die Reinigung und in vitro Expansion von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen aus ganzen peripheren Blut und deren Visualisierung mit Hilfe der MHC-Klasse II Tetramere. Tetramere erlauben die direkte Visualisierung von T-Zellen mit einem einzigen Antigen-Spezifität und definierte MHC-Klasse II Einschränkung.</p>

Visualizing Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mit MHC Klasse II Tetramere

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Research

JoVE Journal

Biology

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-Lymphozyten Erfassen mit einem Einweg-Mikrofluidik-Chip für HIV

Forschung

Biologie

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells <em>In situ</em>

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Eine Technik, um gleichzeitig zu visualisieren Virus-spezifische CD8 + T-Zellen und Virus-infizierten Zellen<em> In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolierung von Valvular Endothelzellen

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Cell Specific Analysis of <em>Arabidopsis</em> Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Zellspezifische Analyse<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blätter mit Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Visualisierung Bakterien in Nematoden durch Fluoreszenzmikroskopie

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Ein hoher Durchsatz MHC II-Bindungsassay für die quantitative Analyse von Peptid-Epitope

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Der Nachweis von intrazellulären Genexpression in lebenden Zellen der Maus, Mensch und Schwein Origin Mit Fluoreszenz-markierter Nanopartikel

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in <em>C. elegans</em> Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwendung von Open-Source-Werkzeuge

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Isolation of CD4<sup>+</sup> T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Isolierung von CD4<sup>+</sup> T-Zellen und Analyse von zirkulierenden T-follikulären Helfer (cTfh) Zelle Teilmengen von peripheren Blut mittels 6-Farb Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...