Name: visualizing antigen specific cd4+ t cells using mhc class ii tetramers
Uploaded: 2009-03-06T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers at JoVE.com

<p class="jove_content"> Agradecemos a Dick Foley y Kimball Leigh por su papel clave en la filmación y producción de vídeo. </p>

<p class="jove_title"> 1. Sangre periférica de células mononucleares (PBMC) de aislamiento </p><ol><li> Obtener una muestra de sangre - la sangre deben ser recogidas en jeringas o tubos de sangre y anticoagulada con heparina (1:50 ratio) para prevenir la coagulación. Esperar un rendimiento de alrededor de 1 × 10 <sup>6</sup> PBMC por ml de sangre - aproximadamente el 40% de los cuales se CD4 positivos (CD4 +) las células T. </li><li> Alícuota de la sangre en tubos de 50 ml cónico de 25 ml por tubo. Si la sangre se ha separado, mezcle sua...

<ol>
	<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4++T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen.">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> <em style='font-style: italic'>J. Clin. Invest</em>. <b>104</b>, R63-R67 (1999).</li><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetramer-guided+epitope+mapping:+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4++T+cell+epitopes+from+complex+antigens.">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> <em style='font-style: italic'>J. Immunol</em>. <b>166</b>, 6665-6670 (2001).</li></ol>

<p class="jove_content"> Comprender el papel de las células CD4 + T en la inmunidad es de fundamental importancia. Sin embargo, CD4 + antígeno específico de células T puede ser difícil de detectar y aislar de manera artesanal. Por el contrario, tetrámeros de MHC de clase II permite la visualización directa de las células CD4 + T con el antígeno específico deseado. Este vídeo demuestra el aislamiento, purificación y amplificación in vitro de células T CD4 + y su posterior visualización utilizando tetrámeros. Tetrámeros Clase II ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Class 2 Laminar flow biosafety cabinet</td>
<td>equipment</td>
<td>Thermo Forma</td>
<td>1200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>50 mL conical Tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>47747-182</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>1X PBS (Ca/Mg free)</td>
<td>Reagent</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30028.02</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Ficoll-paque PLUS</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1440-03</td>
<td>foil wrapped to protect from light</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipet Aid XP</td>
<td>equipment</td>
<td>Drummond</td>
<td>4-000-101</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>10 mL pipet</td>
<td>equipment</td>
<td>Corning/Costar</td>
<td>CLS4492</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Aerosolve Canisters</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>359481</td>
<td>with 50 mL inserts</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>GS-6R</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipets </td>
<td>equipment</td>
<td>Samco</td>
<td>202-20S</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipets</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>14672-200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemolytic Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T6146</td>
<td>0.2% in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemocytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR </td>
<td>15170-208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL conical tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>05-527-90</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Running Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-155</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>EasySep&reg;   Magnet</td>
<td>equipment</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>18000</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL polypropylene tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352063</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Reagent</td>
<td> Invitrogen</td>
<td>22400-089</td>
<td>with 25 mM HEPES</td>
</tr>
<tr>
<td>Pooled human serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>1570-063</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>500mL 0.22 micron bottle top filter</td>
<td>equipment</td>
<td>Nalgene</td>
<td>595-3320</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>48-well plate</td>
<td>equipment</td>
<td>Costar</td>
<td>3548</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>37&deg;C CO<sub>2</sub> incubator</td>
<td>equipment</td>
<td>Sanyo Scientific</td>
<td>MCO-18AIC</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL synthetic peptide</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Custom synthesis from any peptide vendor</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL FACS tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352008</td>
<td>Polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Peptide loaded class II tetramer (as described)</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Prepared by the BRI tetramer core</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD3</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD pharmingen</td>
<td>347344</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD4</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>17-0049-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD25</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>11-0259-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Facs Calibur Flow Cytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>342975</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

visualizing antigen specific cd4+ t cells using mhc class ii tetramers

<p class="jove_content">Complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase II tetrámeros permite la visualización directa de las células CD4 + antígeno específico de células T por citometría de flujo. Este método se basa en la interacción altamente específica entre el péptido cargado MHC y el receptor de células T correspondientes. Mientras que la afinidad de un único MHC / péptido molécula es baja, el entrecruzamiento complejos MHC / péptido con estreptavidina aumenta la avidez de la interacción, lo que permite su uso como reactivos de coloración. Debido a las frecuencias relativamente bajo de células CD4 + T (~ 1 en 300.000 para una sola especificidad), este ensayo utiliza un paso de amplificación in vitro para aumentar su umbral de detección. Las células mononucleares se purifican a partir de sangre periférica por subyace Ficoll. Las células CD4 + se separan por selección negativa con un cóctel de anticuerpos con biotina y anti-biotina marcada partículas magnéticas. El uso de células adherentes de la fracción de células CD4 en las células presentadoras de antígeno, células T CD4 + se amplió en los medios de comunicación mediante la adición de un péptido antigénico e IL-2. Las células se expanden son manchadas con la correspondiente clase II tetrámero mediante la incubación a 37 ° C durante una hora y posteriormente teñidos con anticuerpos de superficie, tales como anti-CD4, anti-CD3 y anti-CD25. Después de etiquetado, las células pueden ser directamente analizadas por citometría de flujo. Las células tetrámero positivo generalmente se forman una población distinta entre los CD4 + células ampliado. Tetrámero células positivas suelen ser CD25 + y CD4 alta frecuencia. Debido a que el nivel de tinción de fondo tetrámero puede variar, los resultados positivos de tinción debe estar siempre en comparación con la tinción de las mismas células con un tetrámero irrelevante. Múltiples variaciones de este ensayo básicos son posibles. Tetrámero células positivas pueden ser clasificados para su posterior análisis fenotípico, la inclusión en ELISPOT o los ensayos de proliferación, u otras pruebas secundarias. Varios grupos han demostrado también co-tinción con tetrámeros y, o bien anti-citoquinas y anticuerpos anti-FoxP3.</p>

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Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

<p class="jove_content">Este procedimiento muestra la purificación y la expansión in vitro de las células CD4 + antígeno específico de células T de sangre periférica y su visualización utilizando tetrámeros de MHC de clase II. Tetrámeros permitir la visualización directa de las células T con una especificidad de antígeno único y definido restricción MHC de clase II.</p>

Visualización de antígeno específico de células T CD4 + con MHC de clase II tetrámeros

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Investigación

Biología

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