Name: visualizing antigen specific cd4+ t cells using mhc class ii tetramers
Uploaded: 2009-03-06T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers at JoVE.com

<p class="jove_content"> Vi tackar Dick Foley och Leigh Kimball för nyckelroller i filma och videoproduktion. </p>

<p class="jove_title"> 1. Perifera mononukleära celler (PBMC) isolering </p><ol><li> Skaffa ett blodprov - Blod ska samlas i sprutor eller rör blod och anti-koagulerat med heparin (1:50 ratio) för att förhindra koagulering. Räkna med en avkastning på ca 1 × 10 <sup>6</sup> PBMC per ml blod - cirka 40% av dessa kommer att CD4-positiva (CD4 +) T-celler. </li><li> Alikvotera blodet i 50 ml koniska rör, 25 ml per rör. Om blod har separerat, blanda försiktigt innan alikvotering att distribuera plasma </li><li> Tillsätt PBS, vilket den tot...

<ol>
	<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4++T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen.">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> <em style='font-style: italic'>J. Clin. Invest</em>. <b>104</b>, R63-R67 (1999).</li><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetramer-guided+epitope+mapping:+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4++T+cell+epitopes+from+complex+antigens.">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> <em style='font-style: italic'>J. Immunol</em>. <b>166</b>, 6665-6670 (2001).</li></ol>

<p class="jove_content"> Att förstå betydelsen av CD4 + T-celler i immunitet är av grundläggande betydelse. Däremot kan antigen CD4 + T-celler vara svårt att upptäcka och isolera med traditionella metoder. Däremot MHC klass II tetramers möjligt att direkt visualisering av CD4 + T-celler med önskad antigenspecificitet. Denna video visar isolering, rening, och in vitro amplifiering av CD4 + T-celler och deras efterföljande visualisering med hjälp tetramers. Klass II Tetramers är fluorescerande protein konjugat som består av lösliga...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Class 2 Laminar flow biosafety cabinet</td>
<td>equipment</td>
<td>Thermo Forma</td>
<td>1200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>50 mL conical Tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>47747-182</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>1X PBS (Ca/Mg free)</td>
<td>Reagent</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30028.02</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Ficoll-paque PLUS</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1440-03</td>
<td>foil wrapped to protect from light</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipet Aid XP</td>
<td>equipment</td>
<td>Drummond</td>
<td>4-000-101</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>10 mL pipet</td>
<td>equipment</td>
<td>Corning/Costar</td>
<td>CLS4492</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Aerosolve Canisters</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>359481</td>
<td>with 50 mL inserts</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>GS-6R</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipets </td>
<td>equipment</td>
<td>Samco</td>
<td>202-20S</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipets</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>14672-200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemolytic Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T6146</td>
<td>0.2% in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemocytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR </td>
<td>15170-208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL conical tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>05-527-90</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Running Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-155</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>EasySep&reg;   Magnet</td>
<td>equipment</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>18000</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL polypropylene tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352063</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Reagent</td>
<td> Invitrogen</td>
<td>22400-089</td>
<td>with 25 mM HEPES</td>
</tr>
<tr>
<td>Pooled human serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>1570-063</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>500mL 0.22 micron bottle top filter</td>
<td>equipment</td>
<td>Nalgene</td>
<td>595-3320</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>48-well plate</td>
<td>equipment</td>
<td>Costar</td>
<td>3548</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>37&deg;C CO<sub>2</sub> incubator</td>
<td>equipment</td>
<td>Sanyo Scientific</td>
<td>MCO-18AIC</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL synthetic peptide</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Custom synthesis from any peptide vendor</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL FACS tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352008</td>
<td>Polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Peptide loaded class II tetramer (as described)</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Prepared by the BRI tetramer core</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD3</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD pharmingen</td>
<td>347344</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD4</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>17-0049-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD25</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>11-0259-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Facs Calibur Flow Cytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>342975</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

visualizing antigen specific cd4+ t cells using mhc class ii tetramers

<p class="jove_content">Stora histocompatibility komplex (MHC) klass II tetramers tillåter direkt visualisering av antigen CD4 + T-celler med flödescytometri. Denna metod förlitar sig på den mycket specifika interaktionen mellan peptid laddas MHC och motsvarande T-cells receptorn. Medan affinitet av en enda MHC / peptid molekylen är låg, tvärbindande MHC / peptid komplex med streptavidin ökar aviditet av samverkan, vilket gör att de används som färgning reagenser. På grund av den relativt låga frekvenser av CD4 + T-celler (~ 1 på 300 tusen för en enda specificitet) denna analys använder en in vitro amplifieringssteg att öka sin tröskel för upptäckt. Mononukleära celler renas från perifert blod med Ficoll underlag. CD4 + celler separeras därefter genom negativa val med biotinylerad antikropp cocktail och anti-biotin märkt magnetiska kulor. Använda anhängare celler från CD4-celler delen som antigenpresenterande celler, CD4 + T-celler utvidgas i media genom att lägga till en antigen peptid och IL-2. Den utökade cellerna färgas med motsvarande klass II tetramer genom att inkubera vid 37 ° C i en timme och sedan färgas med yta antikroppar som anti-CD4, anti-CD3 och anti-CD25. Efter märkning kan cellerna direkt analyseras med flödescytometri. Den tetramer positiva celler bildar oftast en distinkt population bland de utökade CD4 + celler. Tetramer positiva celler är oftast CD25 + och ofta CD4 hög. Eftersom nivån av bakgrunden tetramer färgning kan variera, bör positiv färgning resultat alltid jämföras med färgning av samma celler med en irrelevant tetramer. Flera varianter av denna grundläggande analys är möjliga. Tetramer positiva celler kan sorteras för vidare fenotypisk analys, ingå i ELISPOT eller analyser spridning eller andra sekundära analyser. Flera grupper har också visat co-färgning hjälp tetramers och antingen mot cytokin eller anti-FOXP3 antikroppar.</p>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers at JoVE.com

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

<p class="jove_content">Detta förfarande visar på rening och in vitro utbyggnad av antigen CD4 + T-celler från hela perifert blod och visualisering med hjälp av MHC klass II tetramers. Tetramers tillåter direkt visualisering av T-celler med en enda antigenspecificitet och definieras MHC klass II begränsning.</p>

Visualisering antigenspecifikt CD4 + T celler med MHC klass II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Research

JoVE Journal

Biology

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-lymfocyter ta med en engångs Mikroflödessystem Chip för HIV

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolering av CD4 + T-celler från Noder Mus Lymph Använda Miltenyi MACS Rening

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells <em>In situ</em>

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

En teknik för att samtidigt Visualisera Virus-Särskilda CD8 + T-celler och virusinfekterade celler<em> In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolering av valvulär endotelceller

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Cell Specific Analysis of <em>Arabidopsis</em> Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell särskild analys av<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blad Använda fluorescensaktiverad cellsortering

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Visualisering Bakterier i Nematoder med fluorescensmikroskopi

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

En hög genomströmning MHC II-bindningsanalys för kvantitativ analys av peptidepitoper

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Detektion av intracellulära genuttryck i levande celler av Murine, Mänsklig och svin användning av fluorescens-märkta Nanopartiklar

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in <em>C. elegans</em> Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Spårning och kvantifiera utvecklingsprocesser i<em&gt; C. elegans</em&gt; Använda Open-source-verktyg

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Isolation of CD4<sup>+</sup> T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Isolering av CD4<sup>+</sup> T-celler och analys av cirkulerande T-follikulär Helper (cTfh) Cell Subsets från perifert blod använder 6-färg flöda flödescytometri

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...